[硕士论文] 水貂α和β干扰素基因的克隆表达及活性分析 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-水貂α和β干扰素基因的克隆表达及活性分析，共69页，32870字

摘要

干扰素是在特定的诱生剂作用下由淋巴细胞分泌的具有抗病毒、影响细胞生长分

化、抗肿瘤和调节免疫功能等活性的糖蛋白。在动物体内自身存在的干扰素极其微量，

以传统的方法难以制备和纯化，因此利用基因工程技术生产重组干扰素是解决这一难

题的有效途径。

根据 Genebank 上报道的水貂 IFN-α 和 IFN-β 序列设计引物，以新鲜水貂肝脏提

取的总基因组为模板经 PCR 扩增出 IFN-α 基因约 564bp 和和 IFN-β 基因约 561bp 两

个片段，按常规方法克隆到 pMD-18T 载体，经蓝白斑筛选和酶切分析获得阳性重组

质粒，并进一步对两片段进行序列分析。分别设计了一对扩增 IFN-α 基因和 IFN-β 基

因成熟肽的引物，在引物的上下游分别带有 EcoRⅠ、XholⅠ酶切位点，以 pMD- IFN-α

和 pMD-IFN-β 为模板，通过 PCR 扩增获得目的片段并且进行回收，用相同的限制性

内切酶酶切表达载体 pET32a 后构建重组表达载体 pET32a - IFN-α 和 pET32a-IFN-β，

并转入 E.coli DH5α 中，得到基因工程菌，经酶切和测序鉴定证明克隆到载体 pET32a

上的外源基因即为水貂 IFN-α 和 IFN-β 成熟肽基因。将重组质粒转入大肠杆菌

BL21(DE3)中进行 IPTG 诱导表达。表达产物进行 SDS-PAGE 与 Western blot 鉴定，可

产生相对分子量约为 36KDa 和 34KDa 的表达产物，表明成功地建立了 IFN-α 和 IFN-β

蛋白的重组表达系统。

对表达的蛋白运用尿素洗涤的方法进行纯化，并通过细胞病变抑制法测定干扰素

的抗病毒活性，结果显示 IFN-α 和 IFN-β 均在 MDCK 细胞上对 VSV 具有一定的的抗

病毒活性。

关键词：水貂；IFN-α 和 IFN-β 基因；原核表达；活性分析

目录

摘 要............…… 1

ABSTRACT ............2

英文缩略词.........… ..……4

第一章 文献综述 ........... 1

1 干扰素的分类与组织细胞来源 ........……1

2 干扰素的分子结构 ..........……2

3 干扰素的一般特性 ..........……5

4 干扰素的产生及其调控 ..........5

5 干扰素的作用机理 ..........……6

6 干扰素的生物学作用 ..........…7

7 国内外应用现状 ...........9

8 试验目的及意义 ..........……10

试验一 水貂 IFN-α 和 IFN-β 基因的克隆与序列分析.....……11

1 材料 ............…11

2 方法 ............…11

3 结果与分析 ...........…20

4 讨论 ............…32

5 小结 ............…34

试验二

水貂 IFN-α和 IFN-β基因原核表达及活性测定.....…35

1. 材料 ............…35

2 方法 ............…36

3 结果与分析 ...........…40

4 讨论 ............…44

5 小结 ............…46

全文总结 ............47

参考文献............47

附录 ............……52

致谢 ............……57

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