[硕士论文] 马铃薯卷叶病毒CP基因的突变、原核表达及抗血清制备 [复制链接]

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硕士论文-马铃薯卷叶病毒CP基因的突变、原核表达及抗血清制备，共66页，33905字

摘 要

本研究的目的是实现马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白（CP）突变基因在大肠杆菌

中的高效表达，并用表达的融合蛋白作为抗原制备抗血清，为进行 PLRV 的 ELISA 检测

及组装 ELISA 检测试剂盒奠定基础。主要的研究结果如下br />
1、采用人工合成 DNA 的方法对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白（CP）基因的密码子进行

了突变。合成了含有 PLRV-CP 基因第 39-624 核苷酸的 639bp 的 Bsp1407I-MssI 片段，

将该基因第 52-177 这段序列（126bp）中精氨酸的稀有密码子进行了同义与错义突变。

合成的 DNA 片段连接在 pMD19-T 载体上获得了重组质粒 pMD-LRCP2。

2、构建了密码子突变基因（LRCP2）的原核表达载体。将本实验室已构建的 PLRV-CP

缺失突变基因的原核表达载体 pBAD-LRCP-126 进行 Bsp1407I 与 MssI 双酶切后回收

4.5Kb 的片段，pMD-LRCP2 同样双酶切后回收 0.64Kb 的片段，两个片段连接获得了重组

质粒 pBAD-LRCP2，即获得了突变基因 LRCP2 的原核表达载体。测序结果显示基因的突变

符合实验设计的要求、基因与载体的连接正确。

3、实现了突变基因（LRCP2）的原核表达。在 37℃，大肠杆菌工程株 TOP10(pBAD-LRCP2)

用 0.2%阿拉伯糖诱导培养 4h 后，SDS-PAGE 显示蛋白图谱上有一条 36 kDa 的诱导表达

蛋白条带，其大小与预期的融合蛋白相符，表明该突变基因实现了在 PBAD 驱动下的原核

诱导表达。

4 、 对 PLRV-CP 缺 失 突 变 基 因 进 行 原 核 表 达 获 得 了 大 量 融 合 蛋 白 。 TOP10

（pBAD-LRCP-126）经诱导、蛋白提取与镍离子亲和层析获得了大量高纯度的融合蛋白。

5、制备出了融合蛋白特异性抗血清。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔制备出了

特异性抗血清，间接ELISA检测显示效价可达1:12000。

6、对PLRV进行了间接ELISA检测。用制备的抗血清对感染PLRV的病叶组织进行间接

ELISA检测，结果呈阳性，结果表明制备的抗血清可用于PLRV的ELISA检测。

关键词:马铃薯卷叶病毒；CP 基因；密码子突变；原核表达；融合蛋白；抗血清制备

目

录

目录

摘 要 ... 1

ABSTRACT ... 2

前言 ..... 4

马铃薯主要病毒及类病毒... 4

1.1马铃薯 X 病毒(Potato virus X，PVX)...... 4

1.2马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y， PVY)和马铃薯 A 病毒(Potato virus A， PVA) . 5

1.3马铃薯 S 病毒(Potato virus S，PVS)...... 5

1.4马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus， PLRV)... 6

1.5马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuberviroid， PSTVd) ....... 7

2马铃薯抗病毒途径及抗病毒育种..... 7

2.1马铃薯抗病毒途径....... 7

2.2马铃薯抗病毒病育种..... 7

3马铃薯的脱毒及脱毒种薯的繁殖..... 8

3.1马铃薯的脱毒机理....... 8

3.2 马铃薯脱毒种薯生产技术. 8

4马铃薯病毒检测技术....... 9

4.1 生物学方法..... 9

4.2分子生物学检测技术.... 10

4.3 电子显微镜技术 12

4.4 血清学检测方法 12

5马铃薯病毒单克隆抗体及多克隆抗体的制备.. 16

5.1马铃薯病毒抗血清的制备 16

5.2马铃薯单克隆抗体的制备 17

6研究的目的和意义 18

材料与方法 20

1材料.... 20

1.1菌种、质粒及载体...... 20

1.2 主要试剂与试剂盒...... 20

2方法.... 20

2.1PLRV-CP 基因的突变 .... 20

2.2 PLRV-CP 突变基因 LRCP2 原核表达载体的构建 ....... 20

2.3突变基因（LRCP2）的表达诱导... 24

2.4表达蛋白的 PAGE 鉴定... 24

2.5PLRV 缺失突变 CP 基因的诱导表达及重组蛋白的制备 25

2.6抗血清的制备.. 27

2.7 抗原的间接 ELISA 检测.. 28

结果与分析 30

1PLRV-CP 基因的突变 ... 30

2PLRV-CP 突变基因原核表达载体的构建 .... 30

3LRCP2 基因的表达诱导.. 35

4PLRV 缺失突变 CP 基因的原核表达及重组 CP 的制备 .. 36

5抗血清的制备. 37

6 抗原的间接 ELISA 检测 .. 37

讨论 . 39

1基因表达系统和表达载体的选择 . 39

2PLRV-CP 基因的原核表达途径 .... 40

3重组 CP 抗血清的制备 .. 40

结论 . 42

参考文献 ....... 44

缩略语表 ....... 49

附录 ... 50

致谢 ... 54

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