[硕士论文] 龙葵金属硫蛋白基因的克隆及其功能分析 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-龙葵金属硫蛋白基因的克隆及其功能分析，共76页，32561字

摘 要

近年来，土壤重金属（Hg、Cu、Pb、Cd、Ni、Mn 等）污染已成为世界性的重大环

境问题，利用植物修复技术来治理重金属污染已成为一项研究热点。金属硫蛋白

(Metallothioneins，MTs)，化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐，是一种低分子量、富含半

胱氨酸可结合重金属的蛋白质，它广泛存在于人体、动物、植物以及微生物体内，且理

化性质基本一致。它可被不良刺激、金属、激素等诱导合成。金属硫蛋白参与重金属的

解毒作用，体内微量元素的储存、转运和代谢，拮抗电离辐射，清除自由基，还与机体

生长发育、延缓衰老及某些疾病有关。目前，已有很多 MT 克隆和利用转基因技术过量

表达 MT 以提高重金属积累量和耐受性的成功报道。

本实验以龙葵为实验材料，利用 RT-PCR 技术分离到 5 个编码Ⅱ类 MT 和 3 个编码

Ⅲ类 MT 的 cDNA 克隆,并运用生物信息学方法进一步分析了龙葵 SorMT2a 基因核酸序

列及氨基酸序列。然后选择其中的 2 个长度不同的Ⅱ类 MT 编码基因 SorMT2a

（EU760481）和 SorMT2c（EU760483）进行了功能分析，构建植物表达载体转化烟草,

通过 PCR 验证了基因的表达情况并将野生型和转基因植株在添加不同浓度 CdCl2 的 MS

培养基中进行了 Cd 耐受性试验，主要研究结果如下：

1. 本实验获得的 5 个 type 2 MT 编码基因的 cDNA 中，SorMT2a、SorMT2b 序列相

似性很高，均编码 82 个氨基酸残基，推导出的氨基酸序列只有 2 个氨基酸残基不同；

SorMT2c、SorMT2d 和 SorMT2e 序列相似性也很高，均编码 77 个氨基酸残基，推导出

的氨基酸序列只有 1 或 2 个氨基酸残基不同。SorMT3a、SorMT3b 序列相似性很高，均

编码 63 个氨基酸残基，推导出的氨基酸序列只有 4 个氨基酸残基不同；SorMT3c 编码

65 个氨基酸残基，与 SorMT3a、SorMT3b 均有 7 个氨基酸残基差异。

2. CLC Main Workbench 5 分析 SorMT2a 蛋白序列表明其含有 17.1%Cys；SorMT2a

蛋白分子量为 8283.59Da，等电点（pI）为 6.7；蛋白的疏水性为 1，有两个蛋白质超家

族区，均为植物金属硫蛋白家族，有 46.2％的可能存在于叶绿体内。分子进化和氨基酸

序列比对分析表明龙葵与辣椒（Capsium chinense,CAI51310）的亲缘关系最近，同源性

为 87%；与黄麻（Corchorus olitorius，ABS72197）的亲缘关系最远，同源性为 45%。

3. 成功构建植物表达载体 pROKⅡ-SorMT2a 和 pROKⅡ-SorMT2c，通过农杆菌介

导法将其和空载体转化烟草并通过 PCR 验证了基因的表达情况，发现转化率很高，可

达 90%。转 SorMT2a 和 SorMT2c 基因烟草对镉的耐受性不同，与野生植株相比，有的

转 SorMT2a 基因植株在 MS 培养基中的 CdCl2 浓度达到 200μM 时仍然生长良好，生物

量和株高均大于野生型植株；而转 SorMT2c 基因植株对镉的耐受性没有提高。这说明

SorMT2a 基因在植物对 Cd 的耐受性中起作用，而 SorMT2c 基因则不起作用，从而也说

明了同一类基因不同家族可能具有不同功能。

关键词：龙葵； 金属硫蛋白； 重金属； RT-PCR； SorMT2a；SorMT2c

目录

摘 要............... 1

Abstract.......... 3

英文缩写词表. 5

前言. 1

1 综述............. 1

1.1 Cd 超积累植物及其耐受机理研究......... 1

1.1.1 Cd 超积累植物...... 1

1.1.2 植物对 Cd 的耐受研究........ 1

1.2 植物金属硫蛋白...... 5

1.2.1 金属硫蛋白的分类............... 5

1.2.2 金属硫蛋白组成、结构和理化性质... 6

1.2.3 金属硫蛋白基因和金属硫蛋白的功能............... 7

2 目的和意义............... 11

试验材料和方法........... 13

1 试验材料.... 13

1.1 植物材料 13

1.2 质粒和菌株............ 13

1.3 主要工具酶及试剂 13

1.4 试验仪器 15

1.5 所用溶液及其配制 15

2 试验方法... 16

2.1 龙葵 MT cDNA 克隆 ............ 16

2.1.1 引物设计............. 16

2.1.2 提取龙葵组织 RNA（Trizol 法） .... 17

2.1.3 cDNA 单链的合成 .............. 17

2.1.4 RT-PCR 扩增 ...... 18

2.1.5 PCR 产物与 T-载体的连接  18

2.1.6 重组质粒的转化. 18

2.1.7 菌液 PCR 鉴定阳性克隆... 19

2.1.8 测序..... 19

2.2 SorMT2a 的生物信息学分析  19

2.2.1 序列的提交及氨基酸序列比对......... 19

2.2.2 SorMT2a 核苷酸序列分析 . 20

2.2.3 龙葵 SorMT2a 蛋白质氨基酸序列的基本分析和功能预测 ........... 20

2.2.4 系统发育分析..... 20

2.3 转龙葵 MT2 烟草及 Cd 耐受性分析... 21

2.3.1 植物表达载体 pROKⅡ-SorMT2 的构建 ........ 21

2.3.2 SorMT2a 和 SorMT2c 转化烟草及 Cd 耐受性分析 ........ 24

结果与分析... 28

1 龙葵 MT cDNA 克隆  28

1.1 龙葵 Total RNA 的提取 ....... 28

1.2 龙葵 MT cDNA 扩增 ............ 28

1.3 菌液 DNA 的 PCR 扩增检测 ............... 29

1.4 重组质粒的序列测定............ 30

2 SorMT2a 生物信息学分析 ....... 30

2.1 氨基酸序列比对.... 30

2.2 核酸序列基本分析 31

2.3 SorMT2a 蛋白序列的分析结果 ............ 31

2.4 同源性分析............ 35

3 转龙葵 MT2 烟草及 Cd 耐受性分析...... 35

3.1 目的基因 MT2a 和 MT2c 的获得 ......... 35

3.2 重组质粒 pROKⅡ-SorMT2 的鉴定 ... 36

3.3 转基因植株的 PCR 检测 ..... 37

3.4 转基因植株 Cd 耐受性分析. 38

讨论............... 42

结论............... 44

参考文献....... 45

攻读硕士学位期间发表的论文... 50

附录............... 51

致谢............... 62

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