[硕士论文] 马铃薯卷叶病毒重组CP的获得及其多克隆抗体的制备 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-马铃薯卷叶病毒重组CP的获得及其多克隆抗体的制备，共64页，36479字

摘 要

本研究的目的是先进行马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白（CP）基因酵母与原核

表达效果的比较，获得大量重组 CP，然后以重组 CP 为抗原制备特异性抗血清、获得多

克隆抗体与酶标记抗体，为进行 PLRV 的 DAS-ELISA 检测试剂盒的制备奠定基础。主

要研究结果如下：

1、以 lacZ 为标记基因、INVSc1 为受体菌研究了酿酒酵母表达系统的有效性。用

LIAc 法获得了转化子，于 30℃经 2%半乳糖诱导 16h～32h 实现了 lacZ 的高水平表达。

用酸洗玻璃珠法提取酵母蛋白，以 X-gal 为底物可方便地检测 lacZ 表达产物的活性，经

改进在酶标板反应孔中可对多个样品的β-半乳糖苷酶活性进行快速检测。

2、构建了 PLRV-CP 基因与 PLRV 缺失突变 CP 基因的酿酒酵母表达载体，并进行

了基因表达的诱导。以 pYES2.1/V5-His/-TOPO 为起始载体，构建了 PLRV-CP 基因

（624bp）的酵母表达载体 pYES-LRCP，工程菌株 INVSc1（pYES-LRCP）经半乳糖诱

导后，SDS-PAGE 图谱上没有预期的表达蛋白。用 PLRV 缺失突变 CP 基因（498bp）的

PCR 产 物 与 pYES2.1/V5-His/-TOPO 连 接 构 建 了 突 变 基 因 的 酵 母 表 达 载 体

pYES-LRCP-126，DNA 测序结果确认了表达载体的正确性。在 30℃,工程菌株 INVSc1

（pYES-LRCP-126）经 2%半乳糖诱导培养 16h，SDS-PAGE 显示蛋白图谱上有一条

23kDa 的特异性蛋白条带，其大小与预期的重组 CP 相符。该表达蛋白呈水溶状态，但

表达量较低。

3、通过原核表达获得了大量 PLRV 的重组 CP。用本课题组构建的 PLRV 缺失突变

CP 基因的原核表达载体 pBAD-LRCP-126 转化受体大肠杆菌 TOP10，工程菌株

TOP10(pBAD-LRCP-126)经 0.2%阿拉伯糖诱导获得了基因的高效表达，提取菌体总蛋白

后经镍离子亲和层析获得了大量高纯度的 PLRV 重组 CP。

4、制备了 PLRV 重组 CP 的特异性抗血清。用纯化的重组 CP 作抗原免疫家兔获得

了抗血清，间接 ELISA 定显示效价可达 1：12800。

5、获得了重组 CP 的多克隆抗体（IgG）与酶标记抗体（IgG-AP）。先用饱和(NH4)2SO4

进行盐析，然后用 ProteinG 亲和层析柱纯化，获得了高纯度的抗体（IgG）。用戊二

醛一步法对纯化的抗体进行标记，获得了 IgG 的碱性磷酸酶标记物（IgG-AP）。

6、进行了 PLRV 的 DAS-ELISA 检测。用制备的 IgG 与酶标抗体（IgG-AP）对感染

PLRV 的叶片进行检测，反应呈阳性，健康的叶片则呈阴性，结果表明获得了 PLRV 的

特异性多克隆抗体与酶标记抗体。

本研究为通过基因工程途径大量制备 PLRV 重组 CP，获得抗体、酶标抗体及组装

DAS-ELISA 试剂盒奠定了基础。

关键词：马铃薯卷叶病毒；CP基因；重组CP；多克隆抗体；酶标抗体；DAS-ELISA

目录

摘要..1

Abstract3

前言 ...1

1马铃薯病毒及类病毒 ............1

1.1马铃薯 X 病毒 ...............1

1.2马铃薯 Y 病毒和马铃薯 A 病毒 .2

1.3马铃薯 S 病毒................2

1.4马铃薯卷叶病毒 ..............2

1.5马铃薯纺锤块茎类病毒病 ......3

2马铃薯抗病毒途径及抗病毒育种 ..4

2.1马铃薯抗病毒途径 ............4

2.2马铃薯抗病毒病育种 ..........4

3马铃薯卷叶病毒基因工程的研究进展 .......................5

3.1复制酶基因介导的抗病性 ......5

3.2CP 基因介导的抗病性 .........6

3.3核酶介导的抗病性 ............6

3.4反义 RNA 介导的抗病性.......6

4马铃薯病毒检测技术 ............7

4.1生物学方法..................7

4.2电镜鉴定法..................7

4.3分子生物学方法 ..............8

4.4免疫学检测方法 ..............9

5病毒抗血清的制备 .............12

5.1以病毒粒体为抗原制备抗血清 .12

5.2以重组 CP 为抗原制备抗血清 .12

研究的目的和意义 ................13

材料与方法......................15

1 材料.15

2 方法 .15

2.1lacZ 基因转化酵母及其表达的诱导......................15

2.1.1酿酒酵母感受态的制备 .....15

2.1.2lacZ 基因表达载体对酵母的转化......................15

2.1.3lacZ 基因表达的诱导与检测 .16

2.1.4lacZ 基因表达条件的比较 ...16

2.2引物的设计与合成 ...........16

2.3PLRV-CP 基因酵母表达载体的构建 .....................16

2.3.1PCR 扩增 ................17

2.3.2PCR 产物的回收 ..........17

2.3.3目的基因片段与酵母起始表达载体的 T-A 连接 ..........17

2.3.4大肠杆菌 TOP10F′的转化...17

2.3.5阳性克隆的筛选与鉴定 .....18

2.3.6酿酒酵母感受态的制备与转化 ........................18

2.3.7pYES-LPCP 对酵母的转化 ..18

2.3.8pYES-LPCP 酵母菌落 PCR 检测 .......................19

2.4PLRV-CP 缺失基因酵母表达载体的构建及基因表达的诱导与检测 .....................19

2.4.1PLRV-CP 缺失基因酵母表达载体的构建 ...............19

2.4.2PLRV-CP 缺失基因重组体的筛选 .....................20

2.4.3 DNA 序列测定 .............20

2.4.4酵母表达载体的蛋白诱导 ...20

2.4.5酵母表达载体蛋白提取 .....20

2.4.6SDS-PAGE 鉴定...........20

2.5 PLRV 缺失突变 CP 基因的原核表达及重组 CP 的制备 ......21

2.5.1基因表达的诱导 ...........21

2.5.2包涵体的提取 .............21

2.5.３ 重组蛋白的纯化 ...........22

2.5.４蛋白的透析、浓缩与定量 ..22

2.6重组 CP 抗血清的制备 .......23

2.6.1 重组 CP 抗血清的制备 .......23

2.6.2 抗血清效价的测定 ..........23

2.7抗体的分离与纯化 ...........23

2.7.1 IgG 的分离 ...............23

2.7.2 IgG 的纯化(Protein G 亲和层析柱).....................24

2.7.3 抗体的间接 ELISA 检测 .....24

2.8抗体的酶标.................24

2.8.1 IgG 的碱性磷酸酶标记 ......24

2.8.2 ELISA 直接法测酶标抗体活性。.......................25

2. 9PLRV 的 DAS-ELISA 检测...25

结果与分析......................26

1 lacZ 基因对酵母的转化及其表达的诱导与检测 ...............26

2PLRV-CP 基因酵母表达载体的构建及其表达诱导 ...........27

3PLRV 缺失突变 CP 基因酵母表达载体的构建及其表达的诱导 .31

4PLRV 缺失突变 CP 基因的原核表达及重组 CP 的制备 .......33

5抗血清的制备及 IgG 的分离、纯化与标记 ..................35

6PLRV 的 DAS-ELISA 检测......36

讨论.38

结论.42

参考文献........................43

缩略语表........................48

附 录 .49

致谢 ..52

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