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适用专业：生物化学与分子生物学
适用年级：大学
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资料简介：
硕士论文-农杆菌介导CBF1基因转化大豆的初步研究，共69页，38042字
摘 要
CBF 是被低温诱导表达的转录因子，它含有与 DNA 结合的 AP2 结合域，通过
与低温诱导基因启动子区域的 CRT/DRE(C-repeat/Dehydration Responsive Element)调控
元件结合，诱导抗寒基因 COR（cold-regulated）的表达，从而提高植物的抗寒性。另
外 CBF 基因在抗旱抗盐碱等方面也有一定的作用。大豆是较难转化的作物之一，这
主要是由于大豆组织培养再生困难、可重复性差、基因型之间差异大等原因造成。本
试验的目的是研究复合注射针介导的大豆遗传转化方法，并利用复合针介导法进行
CBF1 基因转化大豆的研究。
通过对影响复合注射针刺伤大豆种子萌发率主要因素的研究发现：无菌水浸泡大豆
8 h，复合注射针针刺 1 次和添加 3 mg/L 的 AgNO3 时，大豆种子的萌发率最高，达
到 93.1%。农杆菌侵染大豆的萌发率比没有农杆菌侵染的有了明显的下降，从 93.1% 降
至 88.2%。
为了研究复合注射针针刺大豆子叶节不定芽诱导率重要因素的影响，本试验进行了
大豆萌发时间、复合注射针针刺次数及添加不同浓度 AgNO3 三个处理，得出了大豆子
叶节不定芽诱导率最高的条件：即大豆萌发时间为 5 d，针刺 1 次和添加 3 mg/L 的
AgNO3。诱导率达到 66.7%。农杆菌侵染大豆的诱导率比没有农杆菌侵染的大豆有了明
显的下降，从 66.7% 降至 47.0%。
复合针介导下对大豆转化 CBF1 基因进行了研究：
首先是载体构建，先将 pCAMBIA1301 和 PROK2 进行 EcoRI 和 HindIII 双酶
切，将含有启动子和终止子片段连接到 pCAMBIA1301，构成 pCAM-ROK2 中间载体，
然后通过 KpnI 和 BamHI 双酶切 pCAM-ROK2 和 PROK2-CBF1 再进行连接，构建成
pCAM-ROK2-CBF1。该载体的 T-DNA 上具有潮霉素抗性基因、gus 报告基因及 CBF1
基因。CBF1 基因是由 CaMV 35S 启动子启动。
将农杆菌浸染的半片种子在共培养基上共培养 3-5 d 后，在无筛选剂的培养基上（含
250 mg/L 的羧苄青霉素）恢复培养 7-10 d，然后放在含有 10 mg/L 潮霉素的筛选培养
基上进行筛选,得到抗性植株 3 棵。
农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化中，对共培养后的大豆子叶节组织进行了 GUS
瞬时表达检测，采用 PCR 方法和 GUS 组织化学方法对抗性植株进行了鉴定，结果表明 ，
仅 1 棵植株呈现 PCR 阳性。
关键词：大豆；复合注射针；CBF1 基因；子叶节；GUS；遗传转化
目录
中文摘要.................. I
英文摘要............... III
中英文缩略表........ V
1.文献综述.............. 1
1.1 大豆转基因方法............................................. 3
1.1.1 农杆菌介导法............................................. 3
1.1.2 基因枪转化法............................................. 4
1.1.3 聚乙二醇介导法（PEG）.........................5
1.1.4 花粉管通道法............................................. 6
1.1.5 显微注射法... 6
1.1.6 种胚浸泡法... 7
1.1.7 电激法........... 7
1.1.8 超声波辅助农杆菌转化法......................... 7
1.2 大豆遗传转化的基因种类............................ 7
1.2.1 转报告基因和选择标记基因的研究.........8
1.2.2 抗除草剂基因的研究................................. 8
1.2.3 抗虫基因的研究......................................... 8
1.2.4 提高蛋白质含量的遗传转化研究............. 8
1.2.5 转抗病毒和抗真菌病基因的研究............. 9
1.2.6 转抗逆基因的研究..................................... 9
1.3 转基因植株的筛选与检测............................ 9
1.3.1 转基因植株的筛选..................................... 9
1.3.2 转基因植株的检测................................... 10
1.4 转基因植物的安全性问题和商业前景......12
1.4.1 安全性问题. 12
1.4.2 商业前景..... 14
1.5 植物低温诱导转录因子 CBF 基因的研究进展....................................14
1.5.1 CBF 转录因子.......................................... 14
1.5.2 CBF 基因的表达调控.............................. 15
1.6 本研究的目的和意义.................................. 17
2 CBF1 基因植物表达载体的构建.................. 18
2.1 试验材料........ 18
2.1.1 菌株与载体. 18
2.1.2 试剂和材料. 18
2.1.3 仪器材料..... 18
2.2 试验方法........ 18
2.2.1 pCAM-ROK2-CBF1 的载体构建.......... 18
2.3 结果与分析.... 23
2.3.1 中间表达载体的构建............................... 25
2.3.2 植物表达载体 pCAM-ROK2- CBF1 的构建.................................... 25
2.3.3 植物表达载体 pCAM-ROK2- CBF1 转入到农杆菌........................ 26
2.4 载体构建的意义........................................... 27
3 农杆菌介导的大豆遗传转化.......................... 28
3.1 试验材料........ 28
3.1.1 供试大豆品种........................................... 28
3.1.2 菌株和载体.. 28
3.1.3 培养基.......... 28
3.1.4 主要生化试剂............................................ 28
3.2 试验方法........ 28
3.2.1 复合针和复合注射针的制备................... 28
3.2.2 农杆菌的活化及菌液制备....................... 28
3.2.3 复合注射针刺伤处理对大豆种子萌发率影响.....................................29
3.2.4 复合注射针刺伤处理对大豆子叶节不定芽诱导率影响.................... 29
3.2.5 根癌农杆菌介导的大豆遗传转化...........30
3.3 结果与分析.... 32
3.3.1 培养时间对针刺大豆萌发率的影响.......32
3.3.2 针刺次数对大豆萌发率的影响............... 33
3.3.3 AgNO3 浓度对大豆萌发率的影响........... 34
3.3.4 农杆菌侵染下针刺对大豆萌发率的影响34
3.3.5 培养时间对大豆不定芽诱导率的影响...35
3.3.6 针刺次数对不定芽诱导率的影响...........36
3.3.7 AgNO3 浓度对大豆不定芽诱导率的影响............................................36
3.3.8 农杆菌侵染下针刺对大豆不定芽诱导率的影响.................................37
4 转基因大豆的检测......................................... 39
4.1 主要试剂........ 39
4.1.1 GUS 染色液成分....................................... 39
4.1.2 DNA 提取试剂...........................................39
4.1.3 PCR 试剂..... 39
4.2 试验方法........ 39
4.2.1 GUS 染色.... 39
4.2.2 转基因大豆的 PCR 检测....................... 39
4.3 结果与分析.... 40
5 讨论....................43
5.1 复合注射针针刺大豆萌发率重要因素的研究........................................43
5.2 复合注射针针刺大豆子叶节不定芽诱导率重要因素的研究............... 43
5.3 农杆菌介导大豆遗传转化的系统.............. 44
5.3.1 组织来源和发育情况................................ 44
5.3.2 侵染和共培养时间.................................... 44
5.4 转 CBF 基因大豆中存在转录后基因沉默的可能性分析..................... 45
6 结论和后续工作展望...................................... 47
参考文献............... 47
致谢........................55
附录........................56
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