[硕士论文] 对美国白蛾高毒力苏云金芽孢杆菌的筛选及杀虫蛋白基因鉴定 [复制链接]

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硕士论文-对美国白蛾高毒力苏云金芽孢杆菌的筛选及杀虫蛋白基因鉴定，共50页，24331字

摘 要

美国白蛾[Hyphantria cunea (Drury)]食性杂、繁殖量大、适应性强、传播途径广、危

害严重，是一种世界性检疫害虫，在欧亚几十个国家危害非常严重，而对其进行无污染

的有效和持续控制仍然是一个世界性的难题。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，

Bt）是一种特异性极高且对环境友好的微生物杀虫剂，其 cry 基因是应用最为广泛和最

有潜力的抗虫基因。因此，分离和筛选高毒力 Bt 菌株、鉴定杀虫蛋白基因并分离克隆

新的杀虫基因，对研究 Bt 资源的多样性和害虫的生物防治具有十分重要的意义。本试

验采用山东省 17 个地区的土壤中分离 Bt 菌株，通过生物测定筛选对美国白蛾幼虫具有

高毒力的菌株，并对高毒力菌株的晶体蛋白组成和杀虫蛋白基因型进行鉴定，主要结果

如下：

1

采用芽孢杆菌选择性培养基与晶体染色相结合的方法，从山东省 17 个地区 120 份

土样中分离出 Bt 菌株 9 株，Bt 菌株的平均分出率为 7.5%。这些 Bt 菌株的晶体主要形

态包括菱形、圆形和方形等形状。

2

以美国白蛾 3 龄幼虫为试虫，通过生物测定对本试验分离的 9 株 Bt 和实验室保存

的 113 株（共计 122 株）Bt 进行高毒力菌株筛选，当菌液浓度为 1mg/mL 时，对美国白

蛾 3 龄幼虫校正死亡率高于 80%的菌株有 30 株；当稀释至浓度为 0.1mg/mL 进一步筛选

时，得到校正死亡率高于 60%的菌株有 16 株。其中高毒力菌株 B-WRC-1 和 HD-1 的

LC50 分别为 0.009707 mg/mL 和 0.010187 mg/mL。

3

采用 SDS-PAGE 方法对 16 株 Bt 的杀虫晶体蛋白进行分析，结果表明，有 11 株 Bt

菌株中同时含有 130 kDa 和 60 或 70 kDa 的蛋白，1 株同时含有 130 和 140 kDa 的蛋白，

3 株只含有 130 kDa 的蛋白，1 株含有 30 kDa 的蛋白。

4

采用 PCR-RFLP 方法对 16 株 Bt 的杀虫蛋白基因类型进行鉴定，结果表明，有 14

株 Bt 同时含有 cry1 和 cry2 类杀虫蛋白基因，其中 4 株还包括 cry9 类基因，2 株 Bt 中

没有鉴定到已知基因类型，可能含有新的杀虫基因。16 株 Bt 菌株均不含 cry3 和 cry8 类

基因。

关键词：美国白蛾；苏云金芽孢杆菌；菌株分离；杀虫晶体蛋白；cry 基因；生物活性

目 录

中文摘要...... I

英文摘要.....II

前言......1

1. 美国白蛾.1

2. 苏云金芽孢杆菌及应用..........4

3. 研究目的及意义.........13

试验材料与方法...14

1. 试验材料..........14

2. 试验方法..........16

2.1Bt 菌株的分离........16

2.2Bt 菌株的室内生物活性测定......17

2.3 杀虫晶体蛋白 SDS-PAGE 分析 .17

2.4 杀虫晶体蛋白基因型的鉴定.......18

结果与分析21

1.Bt 菌株的分离 .........21

2.对美国白蛾高毒力 Bt 菌株的筛选 .........22

3.高毒力菌株杀虫晶体蛋白 SDS-PAGE 分析 .....28

4.高毒力菌株的杀虫蛋白基因型的鉴定 ...30

讨论.34

结论.36

参考文献....37

致谢.41

硕士期间发表的学术论文.........42

导师组意见43

学位论文独创性声明及学位论文版权使用授权书..44

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