[硕士论文] 转基因玉米寡核苷酸芯片检测及鉴定技术的研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-转基因玉米寡核苷酸芯片检测及鉴定技术的研究，共82页，44412字

摘 要

转基因玉米是目前全世界种植最多的 4 种转基因作物之一，占转基因作物总面积的

22.5 %。转基因作物在给人类带来巨大经济效益和社会效益的同时，也引发了有关转基

因作物环境和食品安全性的激烈争论，各国政府纷纷制定相关政策法规，加强对转基因

农产品的安全管理，开展转基因生物检测技术的研究。迄今为止，全球已有 40 余个国

家和地区要求对转基因食品实施标识管理。因此，转基因植物的检测技术尤其重要。筛

选基因、目的基因、不同基因间的交联结构基因和转入基因与受体植物间的转化体特异

结构基因检测已成为转基因检测的主流。由于 PCR 技术简单方便，曾被广泛应用于转

基因检测，但 PCR 检测无法实现转基因农产品高通量检测。基因芯片技术的出现，实

现了对样品高通量检测和筛选，特别是利用转化体特异性芯片检测技术检测植物基因组

与外源基因的连接区域具有特异性强，灵敏度高、自动化和高效率等优点。

本研究应用寡核苷酸芯片检测技术，根据 7 种转基因玉米 Bt11、Bt176、Mon810、

Mon863、TC1507、GA21 和 NK603 的重组 DNA 结构，进行检测及鉴定，取得了以下

结果。

1、根据转基因玉米重组 DNA 结构，利用 Primer premier 5.0 引物设计软件设计转基

因玉米 Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21 和 NK603 转化体特异性引物，

并进行了 PCR 检测。结果表明，提取的 DNA 符合 PCR 扩增要求，转基因与非转基因

模板 DNA 对每个目的片度的扩增都与预期结果一致。在此基础上分别以玉米内参照基

因(ZSSIIb）作对照，对 Bt11、Mon810、TC1507 和 GA21、NK603、Bt176 分别作两对

四重 PCR 反应。实现在同一个 PCR 反应管中同时对三种转基因玉米及内参照基因的特

异性检测。

2、根据转基因玉米重组 DNA 结构，利用 Primer premier 5.0 和 Oligo 6.0 软件分别

设计和筛选了七种转基因玉米转化体特异性 oligo 探针，制备转基因玉米的寡核苷酸芯

片。结果表明，所产生的有效信号与预期结果一致，与凝胶电泳检测结果相符，表明所

制备的寡核苷酸芯片特异性好。

3、对常用 PCR 检测法和芯片检测法进行灵敏度检测研究。PCR 检测与芯片检测转

基因含量分别为 0.1%、0.01%。结果表明：从检测灵敏度进行评价，寡核苷酸芯片检测

要优于 PCR 检测。

4、针对转基因玉米检测建立并优化了一套三重 PCR 反应体系和两套四重 PCR 反应

体系，可在一张芯片上同时检测多个相关基因。结合多重 PCR 技术可同时有效检测及

鉴定多种转基因玉米，提高了检测的准确度和效率。

关键词：转基因玉米；转化体特异性检测；多重 PCR； 寡核苷酸芯片；检测及鉴定。

目 录

中文摘要 ............. I

英文摘要 .......... III

中英文专业名词及英文缩写........ V

定义 ...VII

主要仪器 ........... X

第一章 前 言..... 1

1.1

PCR 检测方法的研究进展 ........ 2

1.1.1 定性检测方法..... 2

1.1.2 定量检测方法..... 2

1.2 外源蛋白检测法研究进展.......... 3

1.2.1 酶联免疫吸附法( ELISA) ............. 3

1.2.2 免疫试纸条法..... 3

1.3 基因芯片检测技术的研究进展.. 3

1.3.1 基因芯片的原理. 3

1.3.2 基因芯片的类型. 4

1.3.3 基因芯片的研究现状....... 5

1.3.4 基因芯片存在问题及展望............. 5

1.4 多重 PCR 与基因芯片联用技术的研究进展 ....... 6

1.5 其他检测方法的研究进展.......... 7

1.6 转基因玉米检测方法的研究进展............ 7

1.7 研究目的和意义............ 9

1.8 研究的特色与创新之处............ 10

第二章 转基因玉米转化体特异性 PCR 检测技术的研究............. 11

2.1 材料与方法...... 12

2.1.1 试验材料........... 12

2.1.2 试验试剂........... 12

2.1.3DNA 提取与制备 ........... 12

2.1.4PCR 检测引物 . 12

2.1.5PCR 扩增体系和条件的优化...... 13

2.1.6PCR 扩增 ......... 13

2.1.7PCR 产物分析 . 13

2.2 结果与分析...... 13

2.2.1DNA 提取结果 . 13

2.2.2PCR 检测 ......... 14

2.3 结论与讨论.... 22

第三章

转基因玉米基因芯片检测技术的研究... 24

3.1 材料与方法...... 24

3.1.1 试验材料........... 24

3.1.2 试剂与仪器....... 24

3.1.3DNA 提取与制备 ........... 25

3.1.4 引物设计........... 25

3.1.5 探针设计... 25

3.1.6 芯片制备... 25

3.1.7PCR 扩增及产物分析 26

3.1.8 杂交和信号检测........... 26

3.2 结果与分析............ 27

3.2.1 对照探针的设计........... 27

3.2.2 阳性与阴性判定标准... 27

3.2.3 探针的特异性............... 27

3.3 结论与讨论............ 32

第四章 转基因玉米检测方法灵敏度的评价............. 34

4.1 材料与方法............ 34

4.1.1 试验材料... 34

4.1.2 试剂........... 34

4.1.3DNA 提取与制备 ......... 35

4.1.4 引物和探针设计........... 35

4.1.5 芯片制备... 35

4.1.6PCR 扩增及产物分析 35

4.1.7 杂交和信号检测........... 35

4.1.8 灵敏度的验证............... 36

4.2 结果与分析............ 36

4.2.1PCR 检测灵敏度 ......... 36

4.2.2 芯片检测灵敏度........... 39

4.3 讨论与小结.......... 40

第五章 转基因玉米多重 PCR-基因芯片联用检测方法的研究 .. 42

5.1 材料与方法............ 42

5.1.1 材料和仪器................... 42

5.1.2DNA 提取与制备 ......... 43

5.1.3 引物和探针设计........... 43

5.1.4 芯片制备..... 43

5.1.5PCR 扩增及产物分析 43

5.1.6 杂交和信号检测........... 43

5.2 结果与分析............ 43

5.2.1Bt176、GA21、18S rRNA 三重 PCR 反应体系的建立及优化 ............. 43

5.2.2GA21、Bt176、Bt11、18S rRNA 四重 PCR 反应体系的建立及优化 . 44

5.2.3Bt11、Mon810、TC1507、18S rRNA 四重 PCR 反应体系的建立及优化.............. 45

5.2.4 七种转基因玉米混合样本与芯片杂交............... 46

5.3 讨论和结论............ 46

第六章 结论与展望............. 49

6.1 主要结论................. 49

6.2 创新点. 49

6.3 进一步工作计划及展望............. 49

参考文献 .......... 51

附录 .................. 57

致 谢 ................................. 57

硕士期间发表论文......................... 60

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