[硕士论文] 金银花中高纯度绿原酸提取纯化工艺的研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-金银花中高纯度绿原酸提取纯化工艺的研究，共97页，47352字

摘 要

绿原酸具有显著的清热解毒、抗菌消炎等药理作用,高纯度绿原酸主要应用于中成药

的生产。目前,我国高纯度绿原酸都从国外进口，价格十分昂贵。金银花是一种多年生的

藤本灌木，在我国分布很广，从丰富的金银花资源中提取纯化高纯度绿原酸，具有重要

的意义。

本论文以山东平邑金银花为原料，建立薄层层析-紫外分光光度法快速准确测定绿

原酸含量，利用超临界流体萃取技术去除金银花挥发油成分，进而确定了超声波提取绿

原酸的最佳工艺，并通过乙醇沉淀、锌盐沉淀、乙酸乙酯萃取和 DM-130 型大孔树脂等

方法纯化得到绿原酸。最后，对纯化的绿原酸稳定性进行了研究。

结果如下：

1.绿原酸含量测定方法的研究：

通过分析比较，确定实验室快速检测绿原酸含量的方法为薄层层析—紫外分光光度

法。与高效液相色谱法测定结果基本一致，平均回收率达 96.0%，RSD 为 0.86%，精密

度试验的变异系数 0.03%（n=7）。

2.金银花的超临界预处理：

将金银花原料用超临界流体萃取技术去除金银花挥发油，处理后金银花待后序工艺

提取纯化绿原酸。金银花挥发油经分子蒸馏后精制成金银花精油。

超临界萃取条件为：压力 30MPa，温度 45℃，二氧化碳流量 25kg/h，时间 2.5h；

分子蒸馏条件：绝对压力 2-4Pa、转速 250-270r/min、流速 2.1-2.4mL/min、分馏温

度 120℃，得到金银花精油，经气相色谱—质谱分析含有 36 种成分。

3.绿原酸提取工艺研究：

采用超声波法提取绿原酸，将去除挥发油的金银花以乙醇为提取剂，采用单因素和

正交试验的方法，通过多重比较等统计手段，对影响绿原酸提取率的主要因素进行分析，

得到最佳工艺条件：提取溶剂为 60%的乙醇，提取温度 70℃，提取时间 3h，pH 4，料

液比 1:14(W/V)，在此工艺下，绿原酸得率为 1.93%。

4.绿原酸纯化工艺研究：

将绿原酸提取液通过乙醇沉淀、锌盐沉淀、乙酸乙酯萃取后经液相色谱—电喷雾串

联质谱分析，最后采取水反萃工艺等纯化方法。

①乙醇沉淀：选取 90%乙醇作为沉淀剂，料液比 1:5(V/V)，pH 4，在 3-4℃条件下

冷析 1h，能够保证沉淀充分，绿原酸以分子形式存在。

②锌盐沉淀：pH 5.5-5.7，200mg/mL 绿原酸提取物 15mL 用 1mol/L 的 ZnCl2 2.0mL

沉淀完全；正交试验确定绿原酸—锌盐沉淀物转溶的条件：pH 1.5，料液比 1:3（V/V），

60℃水浴中转溶 1 次。

③乙酸乙酯萃取工艺条件：浓缩液初始浓度 40mg/mL，浓缩液与乙酸乙酯用量比

1:2（V/V），萃取两次。将乙酸乙酯层经液相色谱—电喷雾串联质谱（HPLC-ESI/MS2）

分析，主要杂质成分为异绿原酸。

④水反萃工艺：将上步中乙酸乙酯层与水的混合比例确定为 1:3（V/V），能够去除

异绿原酸等杂质成分，将绿原酸萃取到水层。

5.大孔吸附树脂精制绿原酸：

在 5 种大孔吸附树脂中筛选出一种最为适宜的树脂 DM-130，吸附液绿原酸浓度

0.236 mg/mL、pH 为 4、流速 4BV/h；解吸剂为 50%乙醇、流速 2BV/h，pH 为 2。

6.精制绿原酸产品的物理评价：

精制绿原酸产品经高效液相色谱测定含量为 91.2%，样品溶液在 24h 内稳定，精密

度 RSD0.68% (n=5)，重复性试验 RSD 为 0.23%(n=5)，平均回收率 100.88%，平均 RSD

为 0.56%。

对产品物理评价结果：100℃左右, pH 在 7.0 以下稳定性好，H2O2 对绿原酸稳定性

影响较大，应避光保存。

关键词：金银花；绿原酸；提取；纯化；大孔吸附树脂

目 录

摘 要.. 1

Abstract ........... 3

缩略语（Abbreviation）.......... 6

第一章

文献综述...... 1

1.前言. 1

2.研究概述...... 2

2.1 金银花的研究概况 2

2.1.1 金银花中的有效成分...... 2

2.1.2 金银花的药理作用.......... 3

2.1.3 金银花的经济价值及其产品开发............ 3

2.2 绿原酸研究概况.... 4

2.2.1 绿原酸的发现、命名与理化性质............ 4

2.2.2 绿原酸的生物活性研究.. 5

2.2.3 绿原酸的应用研究.......... 7

2.2.4 金银花中绿原酸的提取方法....... 8

2.2.5 金银花中绿原酸的纯化方法..... 10

2.2.6 绿原酸的检测方法........ 11

3.本课题研究目的、意义和研究内容............ 12

3.1 本课题的研究目的、意义............ 12

3.1.1 本课题的研究意义........ 12

3.1.2 本课题的研究目的........ 14

3.2 课题的研究内容.. 14

3.2.1 金银花中绿原酸的测定方法研究.......... 14

3.2.2 金银花超临界预处理工艺研究. 14

3.2.3 金银花中绿原酸的提取工艺研究.......... 14

3.2.4 金银花中绿原酸纯化条件的研究.......... 14

3.2.5 大孔吸附树脂对绿原酸粗品的精制纯化 ........... 15

3.2.6 精制绿原酸的物理评价及含量测定..... 15

第二章 绿原酸含量测定方法的研究 16

1 材料与方法............ 16

1.1 试验试剂与仪器. 16

1.1.1 材料与试剂....... 16

1.1.2 试验仪器........... 16

1.2 试验方法. 17

1.2.1 可见分光光度法在绿原酸提取过程中的定性检测 ........ 17

1.2.2 绿原酸的紫外扫描法定性检测. 17

1.2.3 紫外分光光度法在绿原酸化学纯化过程中的定性检测 17

1.2.4 薄层层析—紫外分光光度法定量检测绿原酸含量 ........ 18

2 结果与分析 19

2.1 绿原酸可见光区检测结果............ 19

2.2 绿原酸最大吸收波长的确定........ 19

2.3 液相色谱法与紫外分光光度法法测定绿原酸含量比较 .. 20

2.4 薄层层析条件的选择结果........... 21

2.5 标准工作曲线的建立....... 21

2.6 液相色谱法与薄层层析—紫外分光光度法测定绿原酸含量比较 22

2.7 薄层层析—紫外分光光度法加样回收试验结果 .. 22

2.8 薄层层析—紫外分光光度法精密度试验结果 ...... 23

3 小结........... 23

第三章 金银花的超临界预处理工艺研究..... 25

1 材料与方法 25

1.1 试验试剂与仪器.. 25

1.1.1 材料与试剂....... 25

1.1.2 试验仪器........... 25

1.2 试验方法. 25

1.2.1 金银花原料的采收标准 25

1.2.2 金银花的超临界预处理方法.... 26

1.2.3 工艺流程........... 26

2

结果与讨论.......... 27

2.1 超临界去除金银花挥发油结果分析......... 27

2.1.1 萃取压力对分离效果的影响..... 27

2.1.2

萃取温度对粗油分离效果的影响....... 28

2.1.3 CO2 流量对粗油分离效果的影响 .......... 29

2.1.4

萃取时间对粗油分离效果的影响....... 29

2.2 MD 的加热温度对金银花粗油精制结果的影响... 30

2.3

金银花精油成分 GC-MS 分析 .. 30

3 小结........... 33

第四章 金银花中绿原酸粗提取工艺研究..... 34

1 材料与方法............ 34

1.1 试验试剂与仪器.. 34

1.1.1 材料与试剂...... 34

1.1.2 试验仪器........... 34

1.2 试验方法 35

1.2.1 金银花中提取绿原酸工艺流程. 35

1.2.2 不同提取溶剂对金银花中绿原酸提取率的影响 ............ 35

1.2.3 提取方法的选择............ 35

1.2.4 超声波法提取金银花中绿原酸的研究 . 35

2 结果与分析............ 37

2.1 绿原酸的粗提取单因素试验结果 37

2.1.1 料液比对绿原酸提取率的影响. 37

2.1.2 温度对绿原酸提取率的影响..... 38

2.1.3 乙醇浓度对绿原酸提取率的影响......... 38

2.1.4 不同提取时间对绿原酸提取率的影响 .. 39

2.1.5 不同 pH 对金银花中绿原酸提取率的影响 ........ 39

2.2 正交试验结果..... 40

3 小结........... 40

第五章 金银花中绿原酸纯化工艺研究......... 42

1 材料与方法 42

1.1 试验试剂与仪器.. 42

1.1.1 材料与试剂....... 42

1.1.2.试验仪器........... 42

1.2 试验方法 42

1.2.1 纯化工艺流程... 42

1.2.2 醇沉除去金银花提取物中杂质成分...... 43

1.2.3 Zn2+沉淀对绿原酸分离效果的研究....... 43

1.2.4 绿原酸-锌盐沉淀物转溶条件的选择..... 44

1.2.5 乙酸乙酯萃取绿原酸工艺研究. 44

1.2.6 HPLC-ESI/MS2 检测乙酸乙酯萃取物中杂质..... 45

1.2.7 水反萃绿原酸工艺研究 45

2 结果与分析............ 45

2.1 乙醇沉淀条件的选择...... 45

2.1.1 乙醇沉淀剂用量的选择 45

2.1.2 冷析时间对澄清效果的影响..... 46

2.2 锌盐沉淀对金银花中绿原酸分离效果的研