[硕士论文] 朊蛋白体外错误折叠循环扩增技术的初步建立 [复制链接]

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硕士论文-朊蛋白体外错误折叠循环扩增技术的初步建立，共51页，28151字

摘要

免疫印迹实验是一种敏感性和特异性很高的诊断朊毒体的方法，但其敏感性和特异

性也受到毒株、蛋白酶K的浓度和作用时间、所用抗体的种类等一些因素的影响。在本

次实验中，我们进行了专门的测定实验对痒病22L小鼠适应株蛋白酶K的最适浓度和免疫

转印中的各种条件进行了认真的摸索，结果表明：蛋白酶K的最佳工作浓度为50ｍｇ/ｍ

Ｌ，一抗的最佳稀释度与孵育时间为1：20000、1h，酶标二抗最佳稀释度与孵育时间1：

10000、1h，最佳分离胶的浓度为12%；凝胶电泳最佳电压为120V；转印最佳电压和时间

为15V15min；最佳封闭液及封闭时间为3%BSA，4℃下过夜。最终我们建立了稳定性高可

重复性强的免疫印迹检测方法为进一步进行扩增实验奠定了良好的基础背景信息。

将痒病小鼠适应毒株22L脑匀浆倍比稀释，确定免疫印迹试验可以检测到的最大稀

释倍数为320倍到640倍之间。以10％正常C57BL/6小鼠脑匀浆为稀释体系，将小鼠适应

毒株22L脑匀浆做200倍稀释，37℃共孵育10h，期间每1h超声波作用1次,以PrPSc为模板

对PrPC进行体外转化。免疫印迹试验结果显示：反应体系中PrPSc得到明显扩增。结果表

明：超声波最适振幅强度为60%；一个循环中超声波作用时间为30s；循环次数越多时扩

增效果越好；超声波作用不能使正常的朊蛋白产生蛋白酶K抗性；使用不同个体脑匀浆

作为底物均能产生扩增效果。我们初步建立的PMCA技术，用于组织中痕量PrPSc的扩增，

有望大幅度提高传统朊毒体检测方法（免疫印迹、ELISA）的灵敏度，为最终朊毒体活

体检测目标的实现打下了坚实的基础。

应用已经建立的朊蛋白体外错误折叠循环扩增技术采用的是 10 倍稀释的方法对朊

毒体的体外连续传代进行了初步的探索，结果表明：第一次稀释和第二次稀释后在超声

波的作用下均能产生十分明显的扩增，表明体外产生的朊毒体也具备诱导朊蛋白转化的

潜在能力。

关键词：蛋白错误折叠循环扩增；朊毒体；传染性海绵状脑病；朊蛋白

目 录

摘要…………………………….…1

英文摘要……………………………….…………………………...….2

英文缩略词表………………..…...4

前言…………………………...…..5

第一部分 文献综述

一、朊毒体及朊蛋白的分子特征及诊断方法研究进展…….……....6

二、蛋白质错误折叠扩增技术研究进展…………………….….…..14

第二部分 试验内容

试验一

免疫印迹法检测鼠脑组织中的朊毒体………………....…17

1.材料与方法……….................…17

2.试验结果.……………………....21

3.讨论………………………………….…………………………...….22

试验二 朊蛋白体外错误折叠技术的初步建立……………………..24

1.材料与法……………………….24

2.结果…………………………….27

3.讨论…………………………….31

试验三

朊毒体体外的连续传代34

1.材料和方法………………….…34

2.结果…………………………….35

3.讨论………………………….....36

结论………………………………37

参考文献…………………………40

致谢………………………………44

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