[硕士论文] 2006-2008年山东鸡传染性支气管炎病毒分离株S1与N基因的分子特征 [复制链接]

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硕士论文-2006-2008年山东鸡传染性支气管炎病毒分离株S1与N基因的分子特征，共55页，32626字

摘要

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由冠状病毒科、冠状病毒属的传染性支

气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV 主

要侵害雏鸡的呼吸道、生殖系统及肾脏，引起产蛋鸡的产蛋量和蛋的品质下降，导致鸡

的生产性能降低。最初认为 IB 主要是幼鸡的一种疾病，但后来发现该病在育成鸡和产

蛋鸡群中也普遍存在。IB 可引起鸡的增重和饲料报酬降低，参与混合感染引起气囊炎使

肉鸡在加工过程中被淘汰，引起产蛋鸡的产蛋率和蛋品质量下降，该病的高度传染性和

传染性支气管炎病毒众多的血清型，使免疫预防复杂化并增加了防控成本。因此具有重

要的经济意义。IBV 粒子含有纤突糖蛋白(S)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)3 种主要结

构蛋白。S 蛋白由 S1 和 S2 两种糖蛋白组成，血凝抑制(HI)抗体和大部分病毒中和(VN)

抗体由 S1 诱导产生。

本研究从我省 6 个地市分离或收集到 2006-2008 年间的 16 株 IBV 病毒，并对其生

物学特性进行了研究，以说明我省 IBV 毒株之间以及与参考毒株之间基因的遗传变异情

况及系统进化关系，同时阐明我省 IBV 的基因型，探讨我省 IB 流行的背景和原因。

疑似 IB 病鸡病变组织处理后接种 9-11 日龄 SPF 鸡胚，接种鸡胚后 72h 内收集尿囊

液，同时观察胚体病变。传 2-5 代后，发现死亡鸡胚表现出生长发育障碍(侏儒胚)，胚

体弥漫性出血，尤其是头部出血比较明显，未死亡鸡胚呈现典型的卷曲胚。病毒尿囊液

对鸡外周血红细胞无凝集活性。病毒尿囊液在电镜下表现为病毒粒子大多呈球形，直径

约为 80-120nm，有囊膜，表面有松散、均匀排列的冠状突起，呈现典型的冠状病毒特

征，而且未发现有其它病毒粒子的存在。所以可初步断定本研究所分离的病毒为鸡传染

性支气管炎病毒。

本研究应用 RT-PCR 方法扩增到了我省 2006-2008 年 6 个地市的 16 株 IBV 现地分离

株的 S1 基因和 N 基因，并将其进行了克隆、序列测定及分析，同时构建了系统进化树，

分析了我省 IBV 分离株与参考毒株之间的系统进化关系。

对此 16 株病毒的 S1 基因序列利用限制性内切酶 HaeⅢ进行了限制性片段长度多态

性(RFLP)分析，可以将 IBV 毒株分为三种不同的基因型。其中 13 个毒株与 LX4 毒株有

相同的 RFLP 分型，两株病毒属于 Mass 基因型，一个毒株有特异的 RFLP 分型。

通过 S1 基因系统进化树分析发现，本实验中所分离的 13 株 IBV 毒株与分布于同一

群内的国内 IB 分离株 LX4 具有较高的同源性（94.5%—99.7%），并且此群毒株间的

S1 基因推导氨基酸序列具有较高的同源性（≥93%），亲缘关系较近，而与我国目前用

于 IB 预防的主要活疫苗 H120 疫苗株属于不同的基因型且氨基酸序列同源性较低，这可

能是导致 IB 疫苗免疫失败或只能产生部分免疫保护作用，以致 IB 在鸡群中不断发生的

主要原因之一。结合 S1 及 N 基因系统进化树分析可知：在 N 基因系统进化树分析中，

毒株 SDTA06111 和 SDJY0701 与毒株 LX4 属于同一进化群，并且此三个毒株具有较高

的氨基酸同源性，然而经过 S1 基因系统进化树分析得知，毒株 SDTA06111 和 SDJY0701

与毒株 LX4 属于不同的基因进化群；同时毒株 SDWF0608 在 N 基因和 S1 基因分析中

也归为不同的基因群。此外还发现，毒株 SDYT0605 与疫苗株 H120 的 N 基因和 S1 基

因的同源性都很高。以上分析表明毒株 SDYT0605 可能是在 IB 疫苗免疫选择压力下所

产生的变异毒株,毒株 SDTA06111、SDJY0701 和毒株 SDWF0608 可能发生了基因重组。

同时，以疫苗株 H120 作为参考毒株，分析发现，16 株 IBV 分离株在 S1 蛋白基因内含

有较多插入和缺失现象，N 基因及其局部功能区序列存在广泛的氨基酸替代现象。

以上分析结果表明，我省 IBV 分离株存在较为广泛的基因突变、插入和缺失，同时，

IBV 毒株间的基因重组也可能是我省 IBV 变异株产生的另一主要原因。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒；山东地方分离株；分子特征

目 录

摘

要………………………………………………. ..1

英文摘要…………………………………………………. ..3

英文缩写词表……………………………...5

前 言…………………………………………..1

鸡传染性支气管炎概述.........1

鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学研究进展...........3

鸡传染性支气管炎的诊断.....9

研究目的和意义..... 11

试验一 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及N基因的序列分析……………………………13

1 材料与方法.............13

1.1 材料....13

1.2 方法....14

2 结果...........19

2.1 IBV 分离株致鸡胚病变特征......19

2.2 尿囊液对鸡红细胞的凝集活性..19

2.3 形态学观察......20

2.4 N基因的扩增与鉴定......20

2.5 N基因序列的比较分析..21

3 讨论...........22

3.1 IBV 分离株的分离及鉴定.......22

3.2 IBV N 基因序列的分析...........23

试验二 IBV S1 基因的遗传变异及RFLP分析…………………………. 24

1 材料与方法.............24

1.1 材料....24

1.2 方法....24

2 结果...........28

2.1 RFLP分型结果 28

2.2 S1 基因的扩增与鉴定 ...29

2.3 基因序列分析..30

3 讨论...........31

结 论……………………………………34

参考文献………………………………..35

致 谢………………………………………41

作者简介……………………………………..42

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