[硕士论文] H1和H3亚型猪流感病毒M及HA基因核酸探针的制备及应用 [复制链接]

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硕士论文-H1和H3亚型猪流感病毒M及HA基因核酸探针的制备及应用，共，47621字

摘 要

猪流感(Swine infuenza, SI)是由正黏病毒科A型流感病毒中的猪流感病毒(SIV)引起

的一种急性、高度接触传染性、群发性的猪呼吸道疾病，目前已发现的SIV至少有H1N1、

H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H9N2和H5N1等8种不同血清亚型，主要是H3N2

和H1N1亚型。由于猪可感染禽流感病毒(AIV)和人流感病毒，被认为是流感病毒的混合

器和新亚型流感病毒的加工场，因此，建立一种简便、快速、准确、敏感性强、特异性

高的诊断SI的方法不但可以减少养猪业的经济损失，而且对食品安全和公共卫生具有重

要的意义。

根据 GenBank 发表的核酸序列，用 DNAstar 软件分析 SIV 的 HA 基因序列间的差

异性，分别设计合成 H1 和 H3 亚型的特异分型引物，并根据 A 型流感病毒的型特异性

基因(M 基因)，设计了 A 型流感病毒的通用引物。应用 RT-PCR 方法分别扩增出了 H1

和 H3 亚型 SIV M 基因 460bp 的特异性片段、H1 亚型 SIV HA 基因 543bp 的特异性片段

和 H3 亚型 SIV HA 基因 488bp 的特异性片段，并分别克隆到 pMD18-T Vector 构建重组

质粒，将各质粒测序后，应用 BLAST 将扩增产物测序结果与相应病毒亚型的核酸序列

进行同源比对，证明扩增出的 H1 和 H3 亚型 SIV M 基因特异性片段与大部分毒株同源

性在 94%以上，H1 亚型 SIV HA 基因特异性片段与大部分毒株同源性在 90%以上，H3

亚型 SIV HA 基因特异性片段与大部分毒株同源性在 98%以上，说明这些片段可用于制

备核酸探针来检测 SIV。

以含有 M 和 HA 基因部分序列的重组质粒为模板进行了 PCR 扩增，扩增产物经地

高辛(DIG)标记后制成核酸探针，与 H1 及 H3 亚型的猪流感病毒(SIV)的 cDNA、猪呼吸

与繁殖综合征病毒(PRRSV)的 cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的 DNA、猪瘟病毒

(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的 DNA 进行斑点杂交,以检测探针的特异性，结果 M

基因核酸探针只与 H1 及 H3 亚型 SIV 的 cDNA 反应呈阳性，H1 亚型的 HA 基因的核酸

探针只与 H1 亚型的 SIV 的 cDNA 杂交呈阳性，H3 亚型的 HA 基因的核酸探针只与 H3

亚型的 SIV 的 cDNA 杂交呈阳性，而与其余病毒杂交呈阴性，说明此三个核酸探针具有

良好的特异性。敏感性试验显示，M 基因核酸探针最低能检出约 5pg/μl 的 H3 亚型的 SIV

RT-PCR 产物，H1 亚型的 HA 基因的核酸探针最低能检出约 7.7pg/μl 的 H1 亚型的 SIV

RT-PCR 产物，H3 亚型的 HA 基因的核酸探针最低能检出约 6pg/μl 的 H3 亚型的 SIV

RT-PCR 产物，说明此三个核酸探针具有较好的敏感性。

用制备的核酸探针对 35 份疑似 SI 临床病料进行斑点杂交检测，结果 M 基因核酸探

针检出阳性 9 份，H1 亚型的 HA 基因的核酸探针检出阳性 4 份，H3 亚型的 HA 基因的

核酸探针检出阳性 4 份，而同时用针对 M 和 HA 基因设计的引物对 35 份病料进行 RT-PCR

检测，也检出相同份数的阳性病料，且阳性病料的编号与前法一致，说明此三个核酸探

针适合于对 H1 和 H3 亚型 SI 的诊断和流行病学调查，可以作为一种临床检测 SI 的分子

生物学方法。

关键词：H1 和 H3 亚型猪流感病毒；M 基因；HA 基因；地高辛标记的核酸探针；斑

点杂交；检测

目录

中文摘要……1

英文摘要……3

英文缩写词表5

前言…………6

文献综述…… 7

1 SI 的流行情况…………… 7

2 SIV 的特性12

3 SIV 蛋白的研究进展……17

4 SI 诊断方法的研究进展…19

5 公共卫生学意义…………25

6 本研究的目的意义………28

试验一 H1 和 H3 亚型猪流感病毒的 M 及 HA 基因部分片段的克隆…29

1 材料与方法29

2 结果与分析35

3 讨论………53

4 小结………54

试验二 H1 和 H3 亚型猪流感病毒 M 及 HA 基因核酸探针的制备……55

1 材料与方法55

2 结果与分析59

3 讨论………63

4 小结………64

试验三 临床病料的检测 …65

1 材料与方法65

2 结果与分析66

3 讨论………69

4 小结………71

全文总结……72

参考文献……73

致谢…………79

攻读硕士期间发表的论文…80

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