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硕士论文-猪圆环病毒Ⅱ型ORF2全基因的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立，共80页，47481字

摘要

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒科圆环病毒属成员，分为 I 型(PCV1)

和 II 型(PCV2)两个型，其基因组为共价闭合环状的单链 DNA，大小约 1.7kb。猪圆环病

毒 ORF2 基因编码病毒的主要结构蛋白 Cap 蛋白，该蛋白具有良好免疫原性。PCV1 和

PCV2 ORF2 基因序列的核苷酸同源性仅为 67%，两种血清型的 Cap 蛋白虽存在共同的

抗原决定簇，但两者没有抗原交叉性，因而是区分 PCV1 和 PCV2 的重要蛋白。PCV2

是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)

等相关疾病的主要病原。给世界养猪业造成巨大的经济损失。了解 PCV2 的流行情况，

可以给 PCV2 的预防和控制提供指导。

根据已测猪Ⅱ型圆环病毒湖南分离株(HN0712)全基因序列，设计一对克隆和表达

HN0607 株 ORF2 全基因(709bp)的引物，将其克隆到原核表达载体 pET-32a 上，经 KpnⅠ、

XhoⅠ酶切，序列测定正确后，将重组表达质粒转化到大肠杆菌 BL21 中，用终浓度

lmmol/L IPTG 诱导，表达产物以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。经 Western-blot 检

测表明，表达的重组蛋白 ORF2 能被 PCV2 阳性血清所识别，具有良好的抗原性。

用镍柱亲和层析法从上清中纯化目的蛋白，以纯化后的目的蛋白作为抗原包被聚乙

烯微量反应板，初步建立检测 PCV2 抗体的间接 ELISA 方法。试验表明：抗原的最佳包

被浓度为 12.81μg/mL，血清最佳稀释度为 1:20；最佳封闭液为 3%BSA，封闭时间为

37℃1.5h 加 4℃过夜，HRP-鼠抗猪 IgG 的最佳工作浓度为 1:12000，最佳血清及酶标二

抗反应条件及时间均为 37℃ 30min，最佳显色时间为 15min，统计学分析后确定阴阳性

的临界值为 0.490。通过上述建立的 ELISA 方法有良好的特异性，重组蛋白不与猪瘟，

猪伪狂犬病，猪繁殖与呼吸综合征病毒的阳性血清发生交叉反应。该方法为我国进行

PCV2 的快速诊断和血清学调查提供了一种监测手段，为试剂盒的研制和开发奠定了前

期工作基础。

关键词：猪Ⅱ型圆环病毒；ORF2 基因；原核表达；间接 ELISA

目 录

摘 要......... 1

ABSTRACT............. 2

缩略词表... 4

文献综述... 5

前言........... 5

1 猪圆环病毒病原学............. 6

2 病毒的分子生物学.............. 8

3 流行病学............. 14

4 PCV2 相关性疾病............. 19

5 诊断...... 22

6 防制...... 26

试验一猪圆环病毒Ⅱ型 ORF2 基因的克隆与原核表达 28

1 材料..... 28

2 方法..... 33

3 结果..... 43

4 讨论..... 47

试验二 PCV2 间接 ELISA 检测方法的建立.... 51

1 材料..... 51

2 方法..... 53

3 结果..... 57

4 讨论...... 65

全文总结. 68

参考文献. 69

致谢......... 78

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• 硕士论文-猪圆环病毒Ⅱ型ORF2全基因的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立
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