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资料简介：
硕士论文-猪蓝耳病病毒NSP2基因主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立，共90页，47017字

摘 要

猪 蓝 耳 病 的 病 原 是 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 (porcine reproductive and

respiratory

syndrome virus, PRRSV)属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员。该病以

母猪流产、死胎和木乃伊胎以及各种年龄猪的呼吸道疾病为特征，可通过胎盘、排泄物、

空气等多种途径传播。2006 年该病以猪表现“无名高热”的形式在我国大流行，给我国

养猪业造成了巨大的经济损失，因此，建立一种快速高效的诊断方法对 PRRSV 的检测及

预防尤为重要。

本文从 HP-PRRSV（JX0601）株细胞毒提取总 RNA，根据 GenBank 上的参考序列设计

了一对扩增 HP-PRRSV 的 NSP2 基因主要抗原区的特异性引物，在引物的上下游引物分别

带有 NcoⅠ、SalⅠ酶切位点。通过 RT-PCR 获得长约 485bp 的目的片段，将其克隆到 pGEM-T

Easy 载体，获得重组质粒 pGEM-dNSP2。

用相同的限制性内切酶酶切阳性质粒pGEM-dNSP2 和表达载体pET-32a后构建重组表

达载体pET-dNSP2，转化宿主菌BL21(DE3)，经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序证

明目的基因以正确的阅读框插入了表达载体。用IPTG诱导重组载体的表达，收集菌液进

行SDS-PAGE电泳，原核表达产物大小约为 38.3KDa。进一步优化IPTG诱导浓度、培养时

间和温度等条件，最后确定以 37 ℃培养至OD600达 0.6 左右，加入IPTG至终浓度为

1mmol/L，再以 37℃继续培养 5h，这样的培养条件下表达量最大，经分析表达蛋白量约

占菌体蛋白的 40.3%。表达产物经Western blot分析，能被PRRSV阳性血清所识别。试验

结果表明高致病性PRRSV（JX0601）NSP2 蛋白主要抗原区在大肠杆菌中高效表达且表达

产物具有抗原性。

目的蛋白经大量诱导表达，上清和沉淀分别进行 SDS-PAGE，证明重组蛋白以可溶性

形式存在于超生裂解液上清中，用镍柱亲和层析法从上清中纯化目的蛋白。以纯化后的

目的蛋白作为抗原包被聚乙烯微量反应板，初步建立了检测 PRRSV 抗体的间接 ELISA 方

法。试验表明：抗原的最适包被浓度为 20μg/mL，血清最适稀释度为 1:160；最适封闭

液为 1%BSA，封闭时间为 37℃ 1h，最佳血清及二抗反应条件及时间均为 37℃ 1h；HRP-

兔抗猪 IgG 的最适工作浓度为 1：5000；底物显色液的最佳反应时间为 15min；统计学

分析后确定阴阳性的临界值为 0.35。通过特异性试验、重复性试验、符合性试验及对临

床样品检测的结果显示，该方法特异、敏感、快速和操作简便。这为进一步开发 PRRSV 抗

体检测试剂盒奠定了基础。

关键词： PRRSV；NSP2 蛋白；原核表达；间接 ELISA

目录

摘 要........1

ABSTRACT........3

英文缩写词......5

文献综述.......6

1 综述前言........6

2 PRRSV的生物学特性..6

3 PRRSV分子生物学研究进展8

4 PRRSV的遗传变异........13

5 PRRSV致病机理的研究进展......16

6 PRRSV免疫学研究进展.......17

7 PRRSV流行病学的研究进展........19

8 PRRSV诊断技术的研究进展21

9 研究的目的意义 .....24

试验一 高致病性猪蓝耳病病毒NSP2基因主要抗原区域在大肠杆菌中的表达.......25

1 材料与方法..25

1.1 材料.25

1.1.1病毒和阳性血清......25

1.1.2载体和菌株...25

1.1.3主要仪器与设备...25

1.1.4 主要试剂与工具酶.........26

1.1.5 主要溶液方...26

1.2 方法...29

1.2.1 RT-PCR.........29

1.2.2 PCR扩增产物的凝胶电泳 ......31

1.2.3 目的基因的回收....31

1.2.4 目的基因与载体的连接..31

1.2.5 感受态细胞的制备........32

1.2.6 连接产物的转化.33

1.2.7 碱裂解法小量制备质粒 DNA 33

1.2.8 重组质粒鉴定 ...33

1.2.9 目的基因序列测定及分析 ...35

1.2.10 原核表达载体的构建..35

1.2.11 重组质粒的诱导表达.....38

1.2.12 最佳诱导条件的确定 .38

1.2.13 表达产物的检测 ....38

2 结果39

2.1 目的基因片段的扩增.........40

2.2 重组质粒 pGEM-dNSP2的鉴定 40

2.3 重组表达质粒pET-dNSP2的鉴定....41

2.4 表达产物的SDS-PAGE电泳检测..42

2.5 表达条件的优化....42

2.6 Western blot 分析...44

3 讨论 ...45

3.1 目的基因片段的选择与扩增.45

3.2 pET-dNSP2重组表达载体的构建45

3.3 关于重组蛋白的表达....45

3.4 表达条件的优化........46

3.5 重组蛋白的表达量及抗原性鉴定.........47

试验二 PRRSV间接 ELISA检测方法的初步建立 ........48

1 材料与方法........48

1.1 材料......48

1.1.1 主要试剂及血清样品.......48

1.1.2 主要仪器设备.........48

1.1.3 用于蛋白纯化溶液的配制.........48

1.1.4 ELISA 所用溶液.......49

1.2 方法........50

1.2.1 重组蛋白的大量诱导表达........50

1.2.2目的蛋白存在情况检测....50

1.2.3 镍柱的处理..50

1.2.4 镍柱的再生..50

1.2.5 目的蛋白的纯化....51

1.2.6 纯化蛋白的浓缩...51

1.2.7 重组蛋白浓度的测定及抗原性的测定 .......52

1.2.8 重组蛋白间接ELISA检测方法的初步研究52

2 结果......54

2.1 重组蛋白的制备及纯化......54

2.2 纯化蛋白浓度测定........55

2.3 间接 ELISA 方法的初步建立 ...56

3 讨论.........63

3.1 目的蛋白存在形式检测...63

3.2 重组蛋白的纯化.....63

3.3 间接ELISA方法的建立........63

3.4 PRRSV NSP2间接ELISA方法建立的意义 65

全文总结...66

参考文献...67

致谢..79

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