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硕士论文-猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定和序列分析及表达N蛋白细胞系的构建，共83页，46940字

摘 要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属成员，为有囊

膜、单股正链 RNA 病毒,能引起猪的一种高度传染性疾病-猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS)，

俗称“猪蓝耳病”。本病以妊娠母猪的繁殖障碍（流产、死胎、木乃伊胎、弱仔）及各

种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。本病给世界养猪业造成巨大的经济损失，现

已成为危害规模化养猪生产的主要疫病之一。

本研究通过 RT-PCR 技术对 50 份送检病料进行 PRRSV 检测，结果 8 份为阳性。将

这 8 份阳性病料在 Marc-145 细胞上进行病毒分离，利用 Nsp2 鉴别诊断单抗进行鉴定，

结果与 Nsp2 基因分析一致，有 6 株为变异株，不与 Nsp2 单抗反应；2 株为经典株，能

与 Nsp2 单抗反应。

本实验将这 8 株分离病毒作为研究对象，根据 GenBank 发表的序列，利用 Primer5.0

分别设计针对 GP5 全基因和 Nsp2 全基因的特异性引物，通过 RT-PCR 分别扩增出 773bp

和 2850bp 的基因片段。对扩增的 GP5 全基因和 Nsp2 全基因进行序列测定，进一步进

行同源性分析和遗传进化树分析。将 GP5 基因序列与 VR-2332、JXA1 等毒株的 GP5

基因进行同源性比较，结果显示，8 个山东分离株 GP5 基因序列之间的同源性为

86.2%~100%；与 VR2332、CH-la 等毒株的同源性为 87.4%~97.8%、89.6%~95%。表明

这些地区流行的毒株在 GP5 基因区域的变异较大。8 个山东分离株 Nsp2 基因序列之间

的同源性为 74.2%~99.9%，与 VR2332、CH-la、JXA1 等毒株的同源性为 78.3%~99.8%，

表明山东地区流行的 PRRSV 毒株在 Nsp2 基因区域的变异也较大。

根据 GP5 基因序列和 Nsp2 全基因序列，将 8 个山东流行毒株与 GenBank 已发表

的其他 PRRSV 毒株进行比较，绘制了遗传进化树。分析结果表明，这些毒株可以分为

2 个分支，DZ、JQ、LC-1、LC-2、SX-1 和 SX-2 等毒株与 JXA1 株的亲缘关系较近，

位于一个大的分支；SD0802、SD0803 毒株与 VR2332 株的亲缘关系较近，位于另一个

大的分支。

根据推导的氨基酸序列比较结果表明，分属于不同分支的 PRRSV 山东流行毒株在

GP5 蛋白的潜在糖基化位点、表位区域（27-30aa，37-45aa 和 180-197aa）的氨基酸均

存在着不同程度的变异。

针对已发表的 N 蛋白基因序列，设计一对引物，通过 RT-PCR 方法扩增得到 N 蛋

白全长基因，将其转入真核表达质粒 pCI-neo，构建了重组真核表达质粒 pCI-neo-N。将

该重组真核表达质粒 pCI-neo-N 转染 Marc-145 细胞，经 G418 加压筛选，获得了抗性细

胞克隆。经 RT-PCR、间接免疫荧光试验（IFA）和 Western-blot 鉴定该细胞克隆能够表

达 N 蛋白，表明获得了表达 N 蛋白的细胞系 Marc-145-N。

本研究通过对 PRRSV GP5 和 Nsp2 基因序列变化的比较，了解 PRRSV 在山东地区

的流行与变异状况，为本病的综合防控提供了重要理论依据。稳定表达 N 蛋白细胞系

的成功构建为下一步全面研究 N 蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征；猪繁殖与呼吸综合征病毒；GP5；Nsp2；N 蛋

白;Marc-145-N 细胞系

目录

中文摘要 ……1

英文摘要…3

英文缩略词……5

前言……6

猪繁殖与呼吸综合征病毒综述……8

第一章 PRRS 毒株的分离、鉴定及 GP5、NSP2 分析23

试验一猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株的分离鉴定23

1.材料与方法………24

2.结果与分析 …………26

3.讨论

29试验二 PRRSV GP5 与 NSP2 序列分析32

1.材料与方法………33

2.结果与分析 ………35

3.讨论

43第二章 表达 N 蛋白细胞系的构建与鉴定46

试验三 pCI-neo-N 真核表达质粒的构建与鉴定 46

1.材料与方法…………46

2.结果与分析…………50

3.讨论……51

试验四 表达 N 蛋白细胞系的筛选与鉴定…………54

1.材料与方法…………54

2.结果与分析…………57

3.讨论……60

结论…………61

参考文献……62

攻读硕士期间发表的论文69

致谢…………70

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