[硕士论文] 牛MSCS生物学特性及体外诱导分化为心肌细胞的研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-牛MSCS生物学特性及体外诱导分化为心肌细胞的研究，共61页，33615字

摘要

【目的】 建立牛骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells ,MSCs）分离

培养体系，研究牛MSCs的生物学特性，并根据其生物学特性及体外诱导分化潜能对其

进行鉴定；探讨牛MSCs体外定向诱导分化为心肌细胞，对诱导分化的心肌细胞进行特

异性标志基因的分子生物学检测，为转基因良种肉牛培育提供种子细胞，提高转基因的

效率。

【方法】

1、通过贴壁筛选法分离培养牛MSCs，观察其生长特性。

2、利用染色、核型分析以及绘制生长曲线和计算贴壁率的方法对纯化后，可以稳

定传代的牛MSCs生物学特性进行了鉴定；在体外成功的定向诱导牛MSCs分化为脂肪样

细胞和成骨样细胞，并对诱导出现的脂肪样细胞和成骨样细胞分别用油红O染色鉴定和

Von Kossa染色鉴定。

3、利用获取纯化稳定的P4、P8、P12代牛MSCs经5umol/L 、10umol/L、15umol/L

三种浓度的5-氮杂胞苷(5-Aza)进行体外诱导分化，经3 周诱导后，随机取10个非重叠视

野（×200），统计并计算心肌细胞的转化率，结果用均数±标准差表示。并对诱导出现的

心肌样细胞进行形态学观察和分子生物学鉴定。

【结果】

获得了高纯度且增殖能力较强的牛 MSCs，并在体外成功诱导其分化为

脂肪样细胞和成骨样细胞，并且染色体核型分析正常，利用 5-Aza 诱导后的细胞大多呈

现长梭形，排列方向一致，有肌管样结构形成。相同代数的牛 MSCs 在 10umol/L 的 5-Aza

作用下诱导效果最佳；在相同浓度的 5-Aza 作用下，牛 MSCs 向心肌细胞的转化率随着

传代次数的增加逐渐降低。P4 代牛 MSCs 在 10umol/L 的 5-Aza 经 3 周的作用下，诱导

分化率最高，达到 48.6%.。RT-PCR 结果显示诱导分化后的细胞明显表达心肌细胞的四

种特异性标志基因，分别是 α-心脏肌动蛋白(378bp)，结蛋白(601bp)，心脏肌钙蛋白 T (331bp)，β-

肌球蛋白重链（β-MHC）(273bp)。

【结论】

1、本试验从牛骨髓中分离培养的这种成纤维贴壁细胞在特定的诱导条件下能够在

体外分化为脂肪样和成骨样细胞，表明其具有多项分化潜能，根据细胞可以稳定传代保

持未分化状态及染色后的形态学特征和染色体核型分析，证明这种细胞具有骨髓间充质

干细胞基本生物学特征。

2、牛MSCs体外经5-氮杂胞苷3 周定向诱导能分化为心肌细胞，对诱导分化后的细

胞进行分子生物学鉴定，表达出了心肌细胞四种特异性标志基因，分别是α-心脏肌动蛋

白(378bp)，结蛋白(601bp)，心脏肌钙蛋白T (331bp)，β-肌球蛋白重链（β-MHC）(273bp)。

3、利用P4代牛MSCs在10umol/L的5-Aza的作用下，体外诱导分化为心肌细胞的效

果最好。

关键词 骨髓间充质干细胞； 5-氮杂胞苷；心肌细胞；RT-PCR

目 录

中文摘要.………….......Ⅰ

英文摘要.…………........ Ⅲ

缩略符号 .. ……… V

文献综述..……………...1

1 MSCs 概述……………..……………1

1.1 MSCs 的表型特征....1

1.2 MSCs 的生物学特性…………..….2

1.3 免疫学特性……………..………….2

1.4 MSCs 作为工程细胞的优越性及研究意义………3

1.5 MSCs 的定向诱导分化…….……..3

2 MSCs 诱导分化为心肌细胞…….….4

2.1 MSCs 体内诱导分化为心肌细胞...5

2.2 MSCs 体外诱导分化为心肌细胞...5

3 MSCs 在心肌修复中的应用…….….7

4 牛 MSCs 诱导分化的研究进展.…....8

5 MSCs 在医学上的应用………..…....9

5.1 在组织工程方面的应用…………...9

5.2 在基因工程方面的应用………..…10

6 目前存在的问题………..………….11

7 前景与展望………...12

试验研究..………….....13

试验一：牛骨髓间充质干细胞的分离培养与生物学特性检测…..…………….....13

1 试验材料……………..……………13

1.1 骨髓样本………....13

1.2 主要试剂及溶液的配制和染色方法….…………13

1.3 试验仪器……………..………...…13

2 试验方法………….……….………13

2.1 牛 MSCs 分离纯化扩增培养…………….….…...14

2.2 牛 MSCs 的生物学特性检测…………….………14

3 结果……….……..….16

3.1 牛 MSCs 的分离和原代培养.…...16

3.2 牛 MSCs 的传代培养………..…..17

3.3 牛 MSCs 的生物特性检测………17

4 讨论………….…..….21

试验二：5-Aza 诱导 MSCs 分化为心肌细胞的分子生物学检测…………..….….24

1 材料和方法……………..…………24

1.1 主要试剂及溶液的配制和染色方法….………...24

1.2 试验仪器……………..………..…24

2 试验方法 ………….24

2.1 牛骨髓间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化….25

2.2 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）鉴定………….……………..25

3 结果……………..….28

3.1 诱导后形态学变化………….…...28

3.2 心肌细胞转化率……………..…..28

3.3 RT-PCR 反应……………..………29

4 讨论………….…..….32

结论.…..34

参考文献………….…..35

附录…...41

附录A 主要试剂……..41

附录B 试验仪器……..42

附录C 主要溶液配制方法…………..43

附录D 细胞染色液的配制及染色方法………….….44

附录E 细胞冷冻和复苏方法…….….46

致谢…... ……47

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