[硕士论文] 鹅源草酸青霉产纤维素酶条件优化及CBHⅠ基因克隆 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-鹅源草酸青霉产纤维素酶条件优化及CBHⅠ基因克隆，共90页，43892字

摘 要

纤维素酶（Cellulase）是降解纤维素生成葡萄糖的一类多组分酶系，包括外切葡聚

糖酶（C1 酶）、内切葡聚糖酶（CX 酶）和 β-葡萄糖苷酶，在食品、酿造行业、农副产品

深加工、饲料、医药、环境保护和化工等领域以及再生能源利用方面具有很广阔的应用

前景。

本试验以鹅源草酸青霉（Penicillium oxalicum Currie ＆ Thom）F67 为试验对象，

采用液体发酵培养法，通过测定 C1 酶、CX 酶、β-葡萄糖苷酶和 FPA 四种酶活，研究不

同培养基组成（碳源、氮源）及发酵条件（通气量、接种量、时间、温度及培养基起始

pH）对菌株产纤维素酶的影响，并根据所得试验结果进一步设计正交试验，最终确定最

佳产酶培养基组成及发酵条件；同时，采用 RT-PCR、兼并 PCR 及 TAIL-PCR 等分子生

物学技术克隆了其外切葡聚糖酶 CBHⅠ基因，构建了真核表达载体，并运用生物信息

学手段进行分析，为研究其分子特性及构建高效纤维素分解菌开辟新的途径。

本试验主要得到如下研究结果：

1. 试验对鹅源草酸青霉 F67 产纤维素酶液体发酵特性研究发现：羧甲基纤维素钠

（适宜添加范围为 0.9g～1.2g/100mL）可以强烈诱导草酸青霉产纤维素酶（P＜0.01）；

以尿素为氮源时（适宜添加范围为 0.6g～1.2g/100mL）各种酶活均维持在较高水平（P

＜0.01）。CX 酶活、C1 酶活和 β-葡聚糖苷酶活最高时的最适接种量分别为 3%、7%和 7%；

发酵温度分别为 30℃、28℃和 30℃；培养基起始 pH 均为 5.5；发酵时间分别为 96h、

72h 和 96h。

2. 根据 NCBI 上已登陆的青霉属纤维素酶 CBHⅠ基因的氨基酸序列设计兼并引物，

通过 RT-PCR 方法扩增了鹅源草酸青霉 F67 CBHⅠ基因片段（登录号为 EU574736），经

Blast 分析，该序列与微紫青霉 CBHⅠ基因的同源性最高，达 84%。在已克隆的 CBHⅠ

基因片段的基础上，试验设计了随机兼并引物和特异性引物，以 cDNA 为模板，采用改

良后的热不对称交错 PCR（TAIL-PCR）技术分别成功克隆了该基因的 3’端和 5’端侧翼

序列。

3. 根据克隆的 CBHⅠ基因 3’端和 5’端侧翼序列分别设计特异性引物，同时引入酶

切位点 EcoRⅠ/NotⅠ，通过 RT-PCR 方法扩增了 CBHⅠ基因序列 1638bp（登录号为

EU727171），编码 545 个氨基酸和一个终止密码子 TAA。提取阳性克隆质粒进行

EcoRⅠ/NotⅠ双酶切，与同样经双酶切的分泌型表达载体 pPIC9K 进行连接转化，挑取

阳性转化子，经 PCR 和酶切鉴定，鹅源草酸青霉 F67 CBHⅠ基因真核表达载体

pPIC9K-CBHⅠ构建成功。

4. 对鹅源草酸青霉 F67 CBHⅠ基因氨基酸序列的生物信息学分析表明：其分子量

为 56.8kD，等电点为 4.9；前 26 个氨基酸可能为信号肽序列，并且具有较强的疏水性；

共具有 43 个磷酸化修饰位点，其中包括 16 个丝氨酸位点，18 个苏氨酸位点和 9 个酪氨

酸位点；结构功能预测表明该蛋白由三个结构功能域组成，分别是糖基化水解酶第 7 家

族的催化功能域（aa30-461）、衔接区（aa462-512）和真菌性纤维素结合域（aa513-545）；

亚细胞定位分析发现草酸青霉 F67 CBHⅠ蛋白有 55.6 %可能存在于细胞外；经同源性分

析，该序列与微紫青霉（Penicillium janthinellum，登录号为 X59054.1）同源性最高，达

76%。

关键词：鹅源草酸青霉；纤维素酶；CBHⅠ；热不对称交错 PCR；生物信息学

目录

中文摘要... ⅰ

英文摘要... ⅲ

缩略符号... ⅴ

前言 ....... ⅵ

文献综述 ... 1

1纤维素酶概述.......... 1

2影响微生物产纤维素酶发酵特性的因素 ............ 3

3外切葡聚糖酶分子生物学研究进展 ... 4

4热不对称交错 PCR 技术（TAIL-PCR） ............. 6

5本试验研究意义 ...... 11

第一章 鹅源草酸青霉 F67 产纤维素酶条件的优化....12

1.1 引言 ... 12

1.2 材料与方法 .......... 12

1.3 结果与分析 .......... 15

1.4 讨论 ... 21

1.5 小结 ... 23

第二章 鹅源草酸青霉 F67 CBHⅠ基因片段及侧翼序列的克隆 .....24

2.1 引言 ... 24

2.2 材料与方法 ......... .24

2.3 结果与分析 .......... 33

2.4 讨论 ... 39

2.5 小结 ... 40

第三章 鹅源草酸青霉 F67 CBHⅠ全长基因的克隆及其真核表达载体的构建 ..... 41

3.1 引言 ... 41

3.2 材料与方法 .......... 41

3.3 结果与分析 .......... 45

3.4 讨论 ... 50

3.5 小结 ... 51

第四章 鹅源草酸青霉 F67 CBHⅠ基因的生物信息学分析 .......... 52

4.1 引言 ... 52

4.2 材料与方法 .......... 52

4.3 结果与分析 .......... 54

4.4 讨论 ... 60

4.5 小结 ... 61

结论 ....... 62

参考文献 .. 63

致 谢 ...... 70

硕士期间发表的论文 ..... 71

资料文件预览：
共1文件夹，1个文件，文件总大小：2.94MB，压缩后大小：1.38MB

• 硕士论文-鹅源草酸青霉产纤维素酶条件优化及CBHⅠ基因克隆
• 硕士论文-鹅源草酸青霉产纤维素酶条件优化及CBHⅠ基因克隆.doc  [2.94MB]