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适用专业：动物遗传育种与繁殖
适用年级：大学
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资料简介：
硕士论文-辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟与体外受精的研究，共60页，35389字
摘 要
为探索出一套适宜的辽宁绒山羊卵母细胞的体外培养系统，满足科研和生产对早期
胚胎的需要，本试验进行了辽宁绒山羊卵泡卵母细胞体外成熟培养和受精的研究。
1.实验比较了切割法和抽吸法从屠宰山羊卵巢表面卵泡采集得到的可用卵母细胞数
及成熟率。结果表明切割法采集得到的可用卵母细胞数（2.52 枚/卵巢）显著高于抽吸法
(1.80 枚/卵巢) (P<0.05)，但成熟率差异不显著。在辽宁绒山羊卵母细胞收集中，切割法
要优于抽吸法。
2.实验检测了收集的卵中成熟卵所占的比率，根据卵丘细胞的完整性将收集到的卵
分为三组，COCs、COCs1-3 和 NOs，成熟卵的比率分别为 1.19 %、2.56 %和 4.96 %，说
明收集的卵中会有少量的成熟卵，而裸卵中成熟卵所占的比率最大。
3. 辽 宁 绒 山 羊 卵 母 细 胞 IVM 条 件 为 ： 39 ℃ 、 5%CO2 饱 和 湿 度 ， 基 础 培 养 液
+10%FCS+l0IU/m1FSH+20ug/mlLH+25IU/m1PMSG；培养 22-24h，成熟率可达 78.44%，大
卵泡卵母细胞成熟率达 85.42%的，这与其他山羊相似。
4.实验将卵母细胞体外培养 16 h、18 h、20 h、24 h、26 h，成熟率分别为 57.90 %、
70.02 %、73.59 %、75.40 %、76.66 %，随培养时间延长成熟率逐步升高，培养 16 h 的
成熟率显著低于 18 -26 h (P＜0.05)，而培养 24 h 和 26 h 的受精率和卵裂率最高，说明
辽宁绒山羊卵母细胞体外培养 18 h 基本达到核成熟，而体外培养 24-26h 可达胞质成熟，
能提高成熟率和受精率。
5.实验用血清培养基和无血清基培养卵母细胞，血清培养基的成熟率（78.44 %）略
高于无血清培养基（74.10 %），但差异不显著(P＞0.05)。说明在辽宁绒山羊可用无血清
培养基进行卵母细胞的体外成熟培养。
6.辽宁绒山羊卵母细胞 IVF 时，悬浮法适合于细管冻精中高活力精子的获取；IVF
条件为：38.5℃、5%CO2 饱和湿度，精子洗涤液和受精液采用 mTyrode’液，获能液采用
mTyrode’液+20μg/ml 肝素钠，受精卵培养液为基础培养液＋20％FCS；受精率和卵裂
率可达 60.63%和 41.75%，这比绵羊的报道要低。
7.实验比较了卵泡直径对卵母细胞回收率和体外培养效果的影响，直径≤2mm、
2.1-5mm 和 5mm 以上三类卵泡的回收率分别为 56.01 %、51.91 %和 50.57 % ，可用卵
的比率分别为 85.42 %、72.75 %和 58.39%，成熟率分别为 96.00 %、73.42 % 和 54.91%。结
果表明：卵母细胞的回收率和可用卵的比率及成熟率均与卵泡直径呈正相关；直径
2.1-5mm 卵泡的卵母细胞受精率和卵裂率分别为 59.15%和 42.50%，显著高于直径﹥5
mm 卵泡和≤2mm 卵泡（P＜0.05），适合体外胚胎的生产；直径≤2mm 卵泡的卵母细
胞因未发育充分体外发育潜能最差；直径﹥5mm 卵泡的卵母细胞可能因体外培养成熟
过度而老化导致受精率和卵裂率降低。
8.实验测定了卵丘细胞对卵母细胞体外成熟和受精的影响，第一步，将一部分COCs
经机械吹打脱除卵丘细胞成为DOs，然后以DOs、DOs（COCs）、DOs（CCs）、COCs四
种方式培养，第二步将所获COCs、COCs1-3、NOs各自单独培养。结果表明，COCs组的
成熟率、受精率和卵裂率分别为82.85 %、60.63 %和41.75 %，极显著高于其它三组（P
＜0.01），卵丘细胞的存在有利于卵母细胞体外成熟和随后的发育，COCs组成熟率、受
精率和卵裂率分别为83.25 %、59.43 %和42.50 %，显著高于COCs1-3组（P＜0.05）且极
显著高于NOs组（P＜0.01），卵丘细胞的完整性也影响着卵母细胞的体外发育。
关键词：辽宁绒山羊；卵母细胞；体外成熟；体外受精
目录
摘要 .......... 1
Abstract........ 3
英文缩写词表................ 5
1 前言............ 1
2 文献综述... 3
2.1 卵母细胞体外成熟的研究历史............... 3
2.2 卵母细胞的成熟机理.............. 4
2.2.1 卵母细胞的核成熟............... 4
2.2.2 卵母细胞的胞质成熟........... 4
2.3 卵母细胞的采集方法.............. 5
2.4 卵母细胞的检查..... 6
2.4.1 未成熟卵母细胞的筛选....... 6
2.4.2 卵母细胞的成熟判断........... 6
2.5 影响卵母细胞体外成熟的因素............... 6
2.5.1 动物种类和年龄.. 6
2.5.2 运输时间和温度.. 6
2.5.3 卵母细胞的类型和形态....... 6
2.5.4 获取卵母细胞的卵泡大小... 6
2.5.5 培养的温度.......... 7
2.5.6 培养时间.............. 7
2.5.7 培养液及其添加成分........... 8
2.6 体外受精 9
2.6.1 受精作用机制...... 9
2.6.2 精子体外获能.....11
2.6.3 影响精子体外获能与受精的因素...... 12
2.6.4 早期胚胎（受精卵）的体外培养....... 14
2.6 本研究的目的和意义............ 14
3 材料和方法............... 16
3.1 材料....... 16
3.1.1 卵巢和冻精......... 16
3.1.2 主要试剂............. 16
3.1.3 仪器与设备......... 16
3.1.4 溶液的配制........ 17
3.2 技术路线............... 17
3.3 方法....... 18
3.3.1 卵巢的采集........ 18
3.3.2 卵母细胞的收集与分组..... 18
3.3.3 卵丘颗粒细胞的收集与处理.............. 19
3.3.4 卵母细胞的体外成熟......... 19
3.3.5 卵母细胞的体外受精......... 20
3.3.6 受精卵的体外培养............. 20
3.4 数据处理................ 20
4 结果与分析.............. 22
4.1 卵母细胞回收........ 22
4.1.1 不同的回收方法收集卵母细胞的效果及体外成熟比较..... 22
4.1.2 卵泡直径对卵母细胞回收效果的影响................ 22
4.1.3 收集的卵母细胞中成熟卵的检测....... 23
4.2 卵母细胞的体外培养............. 24
4.2.1 不同培养温度对绒山羊卵母细胞体外成熟的影响............. 24
4.2.2 培养时间对卵母细胞体外成熟与体外受精的影响............ 24
4.2.3 血清培养基和无血清基对绒山羊卵母细胞体外成熟的影响............. 25
4.2.4 卵泡直径对卵母细胞体外培养的影响................ 25
4.2.5 卵丘细胞对体外成熟和受精的影响... 26
5 讨 论........ 27
5.1 卵母细胞的回收.... 27
5.1.1 不同回收方法对绒山羊卵母细胞数量、质量及成熟率的影响.......... 27
5.1.2 不同卵泡直径对辽宁绒山羊卵母细胞回收效果的影响..... 27
5.1.3 培养前成熟卵的检测.......... 27
5.2 卵母细胞的体外培养........... 28
5.2.1 培养温度对绒山羊卵母细胞体外成熟的影响... 28
5.2.2 培养时间对卵母细胞体外培养的影响................ 28
5.2.3 血清培养基和无血清基对绒山羊卵母细胞体外成熟的影响............. 31
5.2.4 卵泡直径对辽宁绒山羊卵母细胞体外培养效果的影响..... 31
5.2.5 卵丘细胞对体外成熟和受精的影响... 32
6 结 论....... 35
参考文献..... 36
附 录........... 42
致 谢........... 46
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