[硕士论文] 天花粉蛋白突变基因TCSA-S在烟草中的表达、定位及抗性鉴定 [复制链接]

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硕士论文-天花粉蛋白突变基因TCSA-S在烟草中的表达、定位及抗性鉴定，共71页，39989字

摘 要

天花粉蛋白（ Trichosanthin， TCS）属于Ⅰ型植物核糖体失活蛋白（ Ribosome

Inactivating Protein，RIP），主要从药用植物栝楼（Trichosanthes kirilowii）的块根和叶中

提取出来，是一种抗滤过性病原体的植物防御蛋白。本研究应用转基因技术，以普通烟

草品种 K326 和三生烟为外植体，将栝楼天花粉蛋白的突变基因 TCSA-S 与 Gus 基因融合，

通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得了含有目标基因插入序列的烟草转化体，通过分子

生物学验证、细胞学检测以及抗病性试验，研究 TCS 基因的氨基酸序列、结构、功能及

其抗病性机制。主要研究结果如下：

1、采用叶盘法，通过根癌农杆菌介导将含有 TCSA-S 基因的双元载体 pCambia

1301/3132－1 转化烟草，在 25mg/L 潮霉素的筛选条件下，K326 和三生烟的转化率分别

达到 55.9 %和 72.4 %，不含有 TCSA-S基因的空白载体 pCambia 1301 的转化率达到 75.2%。

2、根据突变基因 TCSA-S 基因序列设计特异引物，对 12 株烟草转化体进行 PCR 扩

增，获得含有目标序列、长度为 819bp 的扩增片段。转化载体 DNA 和扩增产物 DNA

测序表明，插入基因的核苷酸序列没有发生碱基的改变。X-gluc 的组织化学法染色，均

能检测到 Gus 基因在转基因植株的根、茎、叶中的表达。表明 TCSA-S 与 Gus 融合基因

已成功转入烟草的基因组中，其编码蛋白 116 和 161 位点的突变并不影响基因整合和表

达。

3、对 Gus 染色组织进行石蜡切片，镜检结果表明，含有 TCSA-S 基因的 pCambia

1301/3132－1 转化植株中，TCSA-S 与 Gus 基因的融合蛋白主要在叶片组织中的气孔、皮

层的薄壁细胞及表皮毛顶端获得表达。表明烟草转化体中突变基因 TCSA-S 的表达产物具

有一定的细胞特异性，其编码蛋白的前导序列对于蛋白产物在细胞中的分布具有一定的

影响。

4、病毒接种试验结果表明，含有 TCSA-S 基因的 pCambia 1301/3132－1 烟草转化植

株、不含有 TCSA-S 基因的 pCambia 1301 烟草转化植株以及对照 K326 植株，在接种 ToMV

和 CMV 以后，均表现出系统花叶的感病症状。接种植株的 SDS-PAGE 电泳显示，感病

植株能够分离出 ToMV 和 CMV 的外壳蛋白。因此，TCS 基因编码蛋白 116 和 161 位点

氨基酸的突变，导致烟草转化植株失去了对病毒 ToMV 和 CMV 的抗病性――说明 TCS

蛋白 116 和 161 位点的氨基酸涉及该蛋白对病毒的特异抗性。

关键词：天花粉蛋白；突变基因；转化；转基因烟草；抗病性

目 录

中文摘要…………..…...……….1

英文摘要………..……...……….2

缩略符号………..……...…….…4

前言………..……...…….…6

第一章、文献综述………………..…7

1 天花粉蛋白基因研究进展…………….…….……… 7

1.1 天花粉蛋白基因在医学上的应用研究…8

1.1.1 在妇产科的应用…8

1.1.2 抗肿瘤活性机制…8

1.1.3 抗 HIV 活性机制………..…………8

1.1.4 广谱抗病毒活性机制………………9

1.2 天花粉蛋白基因在植物中的应用研究…9

1.2.1 对植物病毒的抗性研究……………9

1.2.2 对真菌的抗性研究10

1.2.3 对昆虫的抗性研究……..……..……10

1.2.4 对转基因植株中可溶性蛋白的研究..……..…………10

2 天花粉蛋白基因突变体研究进展………………..………………10

3 植物抗病毒基因工程研究进展…………..…13

3.1 植物病毒基因介导的抗性作用机理……14

3.2 烟草抗病毒基因工程研究进展…………15

第二章、材料与方法…..………17

1 材料…..………………..……..17

1.1 植物材料………..…….. 17

1.2 菌种和质粒….….…….. 17

1.3 药品与主要试剂…………….……….….. 17

2 方法………………..………... 17

2.1 农杆菌的活化与菌液的制备………………..... 17

2.1.1农杆菌感受态细胞的制备及其转化………....…….... 17

2.1.2 根癌农杆菌标准生长曲线的绘制………………..……………18

2.1.3农杆菌转化用菌液的制备……….……...……………..18

2.2 烟草的转化及其转化体的再生……………….……………..18

2.2.1烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生……….…………….…………..18

2.2.2试验处理及其统计分析..…………..19

2.3 天花粉蛋白突变基因在烟草中的转化………….…………….………..……..19

2.4 转基因植株的检测……….………………..……….………..20

2.4.1转基因植株总 DNA 的提取………….…………..…..20

2.4.2转基因植株的 PCR 检测…………….…………..…..20

2.5转基因植株的细胞学检测...……….……….21

2.5.1转基因植株及其对照的处理……………..….………..……………..21

2.5.2石蜡切片………………...……………..…………….…..21

2.5.3转基因植株的细胞学鉴定…………….……………..….23

2.6转基因植株的抗病性检测………………..……………….23

2.6.1转基因植株的病毒接种与观测……..…………….…….23

2.6.2TCA-丙酮法提取植物蛋白……..………………..…….23

2.6.3SDS-PAGE 电泳方法..……………….24

第三章、结果与分析……………....…………...25

1 天花粉蛋白突变基因 TCSA-S 在烟草中的转化……………….…………...25

1.1 根癌农杆菌标准生长曲线的绘制………………..……………25

1.2 烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生…..25

1.3 培养条件对烟草转化率的影响……………..………………26

1.4 天花粉蛋白突变基因 TCSA-S 在烟草中的转化………….….27

1.5 转化体的筛选.……….28

2 转基因植株的检测…………….……….……………..………….29

3 转基因植株的细胞学观察……………..……………..………….29

3.1 转基因烟草的 Gus 基因检测………………...………….29

3.2 转基因烟草的细胞学观察.29

3.2.1 叶片组织细胞学观察…….………..….29

3.2.2 茎的组织细胞学观察……….…………29

3.2.3 根的组织细胞学观察.30

3.2.4 石蜡切片细胞学观察与比较…………….….…………...30

4 转基因植株的抗病性检测..………...…………….……………..30

4.1 ToMV 病毒接种烟草转化体的症状及特征…………..…..……………..31

4.2 CMV 病毒接种烟草转化体的症状及特征.………...…………….……………..31

4.3 感病植株中病毒外壳蛋白测定………………..…..…………..31

第四章、讨 论..….….…...………33

1 影响烟草基因转化率的因素…….…………….33

2 基因转化的受体系统……..……………….…………..………….34

3 植物切片效果的影响因素…35

4 TCSA-S基因表达对植株的损伤..………….……………35

5 天花粉蛋白突变基因TCSA- S的效应…..…………………36

第五章、结 论…….…………39

参考文献…………….…………41

附录……………….………47

附图…………...…………..50

致谢……56

攻读硕士学位期间发表的学术论文……………….………………57

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