[硕士论文] 抗草甘膦转基因豆粕PCR检测方法的建立 [复制链接]

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硕士论文-抗草甘膦转基因豆粕PCR检测方法的建立，共78页，35187字

摘 要

草甘膦是一种有机磷类除草剂，通过基因工程手段在常规大豆品种中导入抗除草剂

基因后获得的大豆加工而成的豆粕就是抗草甘膦转基因大豆豆粕。本研究以抗草甘膦转

基因豆粕为试验材料，进行检测方法研究。目的是为制定转基因豆粕的检测规程提供依

据，为我国转基因产品管理制度的建立与实施提供可行的检测方法。本文通过对四种基

因的检测，初步建立了转基因豆粕的检测方法，获得的结果如下：

1 对转基因豆粕中的 Lectin 基因，CaMV35S 基因，NOS 基因以及 CP4-EPSPS 基因

进行 PCR 反应，经对退火温度和 dNTP 浓度条件优化，结果最佳条件下扩增出目的基因

片断，分别将它们克隆后进行序列测定，并对 CaMV35S 基因和 NOS 基因进行了酶切鉴

定。结果证明目的基因扩增正确。

2 根据已发表序列，将内源基因分别与 CaMV35S 基因，NOS 基因和 CP4-EPSPS

基因进行多重 PCR 扩增，并对它们的退火温度和引物比例进行条件优化，确定 Lectin

与 CaMV335S，NOS 和 CP4-EPSPS 的多重 PCR 反应退火温度和引物不对称比例分别分

别为 61℃，58℃，58℃和 5：1，1：1，1：1。结果证明多重 PCR 能同时扩增出多条目

的条带，快速经济，适合大面积推广。

3 在此基础上，针对 CaMV35S 基因和 NOS 基因设计引物和探针，对扩增产物作杂

交检测。试验结果表明：包被液 EDC 的浓度在 5-15mmol/L 之间 DNA 结合量变化不大；

上下游引物比例 8：1 时适合 ELISA 检测同时适合电泳检测；液相产物和固相产物的杂

交时间分别为 40min 和 60min；变性时间 10min。加入标准对照后则可以使转基因产品

不仅能定性检测而且可以定量检测。

关键词：转基因豆粕；多重 PCR；PCR-ELISA；杂交

目录

中文摘要....i

英文摘要.. ii

缩略符号. iii

文献综述...1

1 全球转基因作物发展概况.....1

1.1 转基因作物种植面积 ..........1

1.2 转基因作物在发达国家和发展中国家的分布 .....2

1.2.1 转基因作物的种类............3

1.2.2 转基因作物的性状分布....4

1.2.3 全球转基因大豆、玉米、棉花、油菜的种植情况 ..........5

1.3 全球转基因大豆生产现状 ..5

1.4 中国转基因大豆进口概况...6

1.5 草甘膦分子特性..6

1.6 抗草甘膦转基因大豆 ..........6

2 转基因食品的安全性问题.....7

2.1 过敏原性 .............7

2.2 毒性成分的影响 .8

2.3 对人和动物健康的影响 ......8

3 转基因作物检测技术及进展.8

3.1 转基因产品的核酸检测技术 ...............8

3.1.1 核酸分子定性检测技术...9

3.1.2 核酸分子定量检测技术.10

3.1.3 转基因产品的蛋白检测技术..........10

3.2 核酸检测技术研究进展.....12

4 各国政府对转基因产品及其加工产品的管理要求 ..............12

5 本试验的目的和意义...........13

研究内容

1 常规 PCR 对转基因豆粕的检测 ..........14

1.1 材料和方法.......14

1.1.1 试验材料........14

1.1.2 主要工具酶及试剂盒 .....14

1.1.3 试剂 ................15

1.1.4 电泳溶液配制.15

1.1.5 引物设计 ........16

1.1.6 试验仪器 ........16

1.1.7 大豆饲料豆粕中的 DNA 提取及质量鉴定.....17

1.1.8 普通 PCR 反应体系和反应条件的建立 ..........18

1.1.9 PCR 扩增产物的回收测序 ..............21

1.1.10 PCR 扩增产物的酶切鉴定 ............22

1.1.11 外源基因普通 PCR 检测灵敏性...23

1.2 试验结果分析...23

1.2.1 DNA 提取方法的质量比较 .............23

1.2.2 退火温度对扩增条件的影响...........24

1.2.3 DNTP 浓度对扩增条件的影响 ........26

1.2.4 PCR 扩增产物的回收测序 ..............28

1.2.5 PCR 扩增产物的酶切鉴定 ..............30

1.2.6 外源基因普通 PCR 检测灵敏性 .....31

1.3 讨论...32

1.3.1 植物基因组 DNA 的提取及质量检测 .............32

1.3.2 抗草甘膦转基因大豆豆粕 PCR 检测方法的优化............33

1.3.3 常规 PCR 产物的确证试验——测序..............33

2 多重 PCR 对转基因豆粕的检测 .........34

2.1 试验材料和方法................34

2.1.1 试验材料 ........34

2.1.2 主要试剂 ........34

2.1.3 引物设计 ........34

2.1.4 试验仪器 ........34

2.1.5 试验方法 ........34

2.2 试验结果分析...38

2.2.1 DNA 提取、浓度测定及质量鉴定 .38

2.2.2 转基因豆粕内外源基因的两重 PCR 检测......38

2.2.3 转基因豆粕多重 PCR 检测.............39

2.3 讨论..39

3 PCR-ELISA 检测方法的建立 ..............41

3.1 试验材料和方法................41

3.1.1 试验材料 ........41

3.1.2 主要试剂 ........41

3.1.3 主要试剂的配制 .............41

3.1.4 引物设计 ........43

3.1.5 试验仪器 ........43

3.1.6 试验方法 ........43

3.2 试验结果分析...45

3.2.1 DNA 提取 .......45

3.2.2 EDC 浓度的确定 .............45

3.2.3 EP 管包被与酶标板包被的差异 .....46

3.2.4 上下游引物配比的确定 .46

3.2.5 杂交时间的确定..............46

3.2.6 变性时间的确定..............47

3.2.7 PCR 液相产物电泳检测 .48

3.2.8 固相杂交产物 ELISA 检测 .............48

3.2.9 杂交检测的灵敏度........49

3.3 讨论...49

结论…………………………………… 50

参考文献.51

附录.....55

致谢.....59

攻读硕士期间发表的学术论文................60

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