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硕士论文-条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(PyTPS)的克隆、遗传转化及与其它藻类TPS 基因的比较遗传学研究，共84页，41010字

摘 要

海藻糖是一种广泛存在于自然界中的非还原性双糖。研究表明它与生物体抗干旱、盐碱、

低温等逆境的能力有关；将大肠杆菌和拟南芥的海藻糖合成酶基因导入植物，可以提高植物

抗干旱、抗盐碱的能力。但对生活于海边潮间带、具有高度抗盐、抗旱能力的海藻的海藻糖

合成酶基因（TPS）的克隆和遗传转化迄今尚未见任何报道。本实验室从条斑紫菜中克隆了

海藻糖合成酶基因（PyTPS），获得了其核 DNA 和 cDNA 序列，二者都为 2727bp，没有内含子。

将对应的蛋白质序列与其它物种的聚类分析得知，PyTPS 与水稻 TPS (OsTPS, Accession No.

XP_475716)和拟南芥 TPS (AtTPS5, Accession No..NP_567538)的同源关系最近（约 40%）。

构建了 PyTPS 基因原核表达载体 pET22b－PyTPS，并将其在大肠杆菌 BL21 中进行了表达；

构建了真核表达载体 pCAMBIA2300-PyTPS，并将其通过农杆菌介导法转入水稻品种 TP309，

经过抗生素筛选和 PCR 检测后，得到 201 个 T0 代转基因植株系。经扩繁、筛选、鉴定，得

到 131 个 T1 代转基因株系，经过 8‰的 NaCl 盐溶液筛选和分子检测后，共得到 78 株阳性

的植株，分别来自 27 个株系。经进一步扩繁、筛选、鉴定，得到三个较纯合的 T2 代转基因

株系；其 PCR 检测和 Southern 杂交检测都呈阳性，表明 PyTPS 基因已整合到这些转基因株

系中。对它们的抗盐性测定表明，它们的抗盐性较对照有明显提高。

随后，利用同源克隆的方法从来自红藻、褐藻及绿藻的七种海藻（海带、坛紫菜、龙须

菜、角叉菜、礁膜、浒苔、孔石莼）的基因组 DNA 中克隆了它们的 TPS 基因, 它们 DNA 序列

与条斑紫菜的大小完全一样，均为 2727bp。用 DNAMAN 软件进行比较分析发现这八种海藻的

TPS 基因 DNA 序列的一致性高于 94％；而它们氨基酸序列的一致性高于 97％，推测它们的

功能可能也是相似的。将推导出的各自的氨基酸序列提交到 PSIPRED 蛋白质结构预测服务器

进行二级结构的预测，发现除了坛紫菜以外，其它七种海藻的 TPS 二级结构间差异很小。选

取海带的 TPS 基因（LjTPS），也构建了其原核表达载体 pET22b－LjTPS，发现它在大肠杆菌

BL21 中表达出的蛋白的大小与 pET22b－PyTPS 表达出的蛋白大小一样.

将获得的八种海藻的 TPS 与其它物种的 TPS 进行了氨基酸序列比对时，发现与其它物种

间的一致性较低，其中一致性最高的是水稻和拟南芥，他们与海藻 TSP 氨基酸序列的一致性

达到 40％,一致性次之的是酵母的 TSP，他们的一致性只有 27％左右；最低的是与大肠杆菌

的 EcOtsAB 的一致性，他们的一致性仅有 20％左右。

在对上述的 TPS 基因的(G+C)含量进行分析时，发现海藻 TPS 基因的(G+C)含量都为 60

％左右，远远高于水稻、拟南芥、酵母和大肠杆菌。

关键词：海藻 TPS 基因的克隆和比较研究，条斑紫菜，耐盐性，

目 录

摘要 … ………… … ……………… ………… .i

Abstract..iii

第一部分

文 献 综 述...1

1 植物基因组学研究……..1

1.1 结构基因组学………..1

1.2 功能基因组学………..2

1.3 比较基因组学………..2

1.4 海藻的基因组学研究.6

2 6-磷酸海藻糖合成酶基因(TPS)的研究概况…………….10

2.1 海藻糖的生物学功能10

2.2 海藻糖的代谢途径及其相关基因 ……………… ..12

2.3 6-磷酸海藻糖合成酶基因(TPS)与植物抗盐性的研究..14

第二部分

第三部分

选题依据和意义………………20

研究内容……21

第一章 条斑紫菜 6-磷酸海藻糖合成酶基因(PyYPS)的克隆和功能研究…...21

1 材料………………. …...21

1.1 海藻材料……………21

1.2 菌株和质粒…………21

1.3 培养基………………21

1.4 试剂22

1.5 主要仪器……………23

1.6 用作转 PyTPS 基因的水稻品种………24

2 方法…24

2.1 PyTPS 基因的分段克隆、测序……….24

2.2 PyTPS 的 cDNA 序列的获得………….27

2.3 PyTPS 二级结构的预测...…………..28

2.4 PyTPS 基因在大肠杆菌 BL21 中的表达………………..28

2.5 PyTPS 基因转化水稻品种 TP309…….30

2.6 T2 代纯合转基因植株的鉴定………..32

3结果与分析 ………… .33

3.1 PyTPS 基因的克隆及序列分析………33

3.2 PyTPS 的 cDNA 序列的获得...............35

3.3 PyTPS 的二级结构的预测……………38

3.4 PyTPS 基因在大肠杆菌 BL21 中的表达……………….40

3.5 PyTPS 基因转化水稻品种 TP309…….41

3.6 T2 代纯合转基因植株的鉴定………..46

4.讨论 ...47

第二章 八种海藻 TPS 基因的初步比较..49

1 材料 ...49

海藻材料 ……… ………… ..49

2 实验方法 ……………..49

2.1 七种海藻 TPS 基因的克隆…………...49

2.2 用 DNAMAN 对获得的八种藻类的 TPS 基因进行分析…50

2.3 八种海藻 TPS 蛋白的二级结构的预测 … … … … … …  … .. 5 0

2.4 海藻 TPS 基因与其他物种的 TPS 基因的比较………..50

2.5 海藻 TPS 基因(G+C)含量与其他物种的 TPS 基因(G+C)含量的比较….50

3 结果 …… ……… ……………… …… ….50

3.1 七种海藻 TPS 基因的克隆…………..50

3.2 用 DNAMAN 对获得的八种海藻的 TPS 基因进行分析...52

3.3 八种海藻 TPS 蛋白的二级结构的预测与比较 … … … … … … . .5 5

3.4 海藻 TPS 基因与其他物种的 TPS 基因的比较………..57

3.5 海藻 TPS 基因与其他物种的 TPS 基因的(G+C)含量比较………………59

4 讨论 …… ……… …………… ….60

第四部分 结论 … ……………… 62

参考文献 ………… …… …… .63

致谢 …… …… …… …… …… .70

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