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硕士论文-欧洲型与美洲型PRRSV特异N蛋白表位基因表达及ELISA抗体检测方法的建立，共65页，39003字

摘 要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的母猪

繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征的一种病毒性传染病。该病毒分为两个型：欧洲型（以

Lelystad Virus 株为代表）和美洲型（以 ATCC VR-2332 株为代表），两者存在一定的抗

原差异性。本研究成功实现了美洲型与欧洲型 PRRSV 特异 N 蛋白抗原表位基因在大肠杆

菌中的表达，并对重组蛋白进行了纯化，利用纯化的重组蛋白初步建立了 PRRSV 抗体检

测间接 ELISA 方法。

1.将针对美洲型与欧洲型 PRRSV 特异 N 蛋白抗原表位基因的重组质粒 pGEX-6P-1-N

与 PQE30-N 分别转化到表达宿主菌 BL21（DE3）与 M15 中，经终浓度为 1mmol/L 的 IPTG37

℃诱导 5h，分别高效表达了美洲型与欧洲型 PRRSV 特异 N 蛋白抗原表位区段即重组蛋白

GST-N 与 HIS-N。Western-Blot 结果表明两种蛋白可分别被美洲型和欧洲型 PRRSV 阳性

血清所识别 ，具有良好的反应原性。

2.利用表达的重组融合蛋白作为抗原，分别建立了检测美洲型和欧洲型 PRRSV 抗体

的间接 ELISA 方法，确定了 GST-N 抗原的最适包被浓度为 4.5μg/ml，最适包被条件为

37℃1h 4℃过夜，以 1%BSA 作为封闭液，检测血清稀释度为 1﹕40，HRP-兔抗猪 IgG 的

最适工作浓度为 1﹕1000; 代检血清与酶标二抗均为 37℃作用 30min。确定阴阳性临界

值为 0.43。初步组装的试剂盒进行现地血清的检测应用,与武汉科前 ELISA 试剂盒的符

合率达 93.2%。HIS-N 抗原的最适包被浓度为 8μg/ml，最适包被条件为 37℃1h 4℃过

夜，代检血清按 1﹕40 稀释，37℃作用 60min。HRP-兔抗猪 IgG 的最适工作浓度为 1﹕

1000，37℃作用 30min。包被的重组蛋白均不与猪瘟、猪伪狂犬病、猪日本乙型脑炎、

猪圆环病毒的阳性血清发生交叉反应，表明建立的 ELISA 诊断方法具有良好的特异性。

美洲型和欧洲型 PRRSV 抗体检测间接 ELISA 方法的建立为我国进行 PRRS 抗体的监测和

流行病学调查提供了一种快速简便的血清学方法。

关键词： PRRSV；美洲型；欧洲型；N 蛋白抗原多肽；表达；纯化；间接 ELISA

目录

摘要………Ⅰ

英文摘要……Ⅱ

英文缩写词表……………………Ⅲ

前言 …………1

文献综述… …1

美洲型与欧洲型 PRRSV 特异 N 蛋白抗原表位基因表达及其产物的纯化………12

1 材料与方法……………………13

2 结果与分析……………………21

3 讨论……25

4 小结………26

PRRSV 欧洲型和美洲型抗体检测间接 ELISA 方法的建立 ………………… 27

1 材料与方法……………………28

2 结果与分析32

3 讨论……43

4 小结……44

结论………45

参考文献……46

致谢…………54

导师组意见 55

学位论文独创性声明……………56

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