[硕士论文] PRRSV ORF5与PCV2 ORF2真核表达载体的构建和PRRSV变异株的分离及... [复制链接]

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硕士论文-PRRSV ORF5与PCV2 ORF2真核表达载体的构建和PRRSV变异株的分离及序列分析，共62页，31800字

摘要：为了研究病毒编码蛋白的结构与功能的关系，并为山东省 PRRS 及 PCV 的防治提

供一种理论和实际依据，本研究对 PRRSV SD1 株的 ORF5 和 PCV SD2 株的 ORF2 进行了测

序，根据哺乳动物细胞真核表达载体 pIRES MCSA MCSB 多克隆位点的序列和 PRRSV SD1

株 ORF5 和 PCV SD2 株的 ORF2 基因阅读框架，同时考虑外源基因的表达量在基因起始密

码子的前面加入 Kozak 序列，分别设计了针对 ORF5、ORF2 的引物 Y1/Y2，H1/H2。将 PCR

产物 ORF2 经双酶切回收后插入真核表达载体 pIRES 得到 pIRES-ORF2，RT-PCR 产物 ORF5

经双酶切回收后插入 pIRES-ORF2 构建成重组质粒 pIRES-ORF2/ORF5。经 PCR、RT-PCR、

双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移载体 pIRES-ORF2/ORF5。

将构建成功的 pIRES-ORF2ORF5 重组质粒用脂质体法转染真核细胞 Marc-145，经

G418 加压筛选获得稳定表达的细胞株，以 PCR、RT-PCR、和间接免疫荧光检测目的蛋白

的表达情况。结果表明：经 PCR、RT-PCR 检测到两种目的基因的转录；间接免疫荧光试

验检测到目的蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光，证明蛋白得到表

达。

首次 在 国内 将 PRRSV

ORF5 与 PCV2 ORF2 同时插入哺乳动物细胞真核表达载体

并进行成功表达，为构建 PRRSV 与 PCV 双基因真核表达载体的研究提供思路和依据。

从 2006 年 6 月份开始，我国南方暴发了严重的猪“高热病”,目前已造成上千万头

猪只的死亡,给养猪业带来了巨大损失。山东省于 2006 年 12 月份开始暴发此病。通过

细胞中传代培养，我们分离出 2 株变异毒株，通过 RT-PCR 技术从中扩增出 PRRSV ORF5

片段，并测其序列。应用 DNASTAR、DNAMAN 序列分析软件对所测的 2 株序列与北美洲原

型（VR-2332 株）、欧洲原型（LV 株）和部分国内外分离株的相应片段进行核苷酸同源

性比较,差异较大，均为强毒株。从而为山东地区无名高热 PRRSV 的控制及疫苗研究提

供一些依据。

总之，本研究成功构建了能同时表达两种主要保护性抗原蛋白的真核表达载体，并

在哺乳动物细胞 Marc-145 中成功表达。本研究为亚单位疫苗的研制奠定了理论和物质

基础，将为 PRRS 及 PC 的防治带来新的技术手段。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒； E 蛋白；猪圆环病毒；ORF2； 哺乳动物细胞；表

达；变异株；PRRSV ORF5

目 录

中文摘要…………Ⅰ

英文摘要…………Ⅱ

英文缩略词………Ⅲ

前言…………1

第一部分 文献综述

综 述 一

猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 （ PRRSV ） 分 子 生 物 学 研 究 进

2综述二

圆环病毒（PCV）分子生物学研究进展…10

第二部分 研究报告

试验一

PCV ORF2 和 PRRSV ORF5 基 因 的 扩 增 与 双 基 因 真 核 表 达 载 体 的 构建 ………………17

1.材料与方法 18

2. 结果 ………22

3.讨论 ………23

试验二

PCV ORF2 和 PRRSV ORF5 双 基 因 真 核 表 达 载 体 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 的 表……………26

1.材料与方法26

2.结果………28

3.讨论………30

试验三 两株无名高热 PRRSV 的分离培养及序列分析32

1.材料与方法32

2.结果………33

3.讨论………37

结论……………40

参考文献………41

致谢……………46

导师组意见……50

学位论文独创性声明………………51

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• 硕士论文-PRRSV ORF5与PCV2 ORF2真核表达载体的构建和PRRSV变异株的分离及序列分析
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