[硕士论文] 水貂生长激素真核重组质粒构建及其表达的研究 [复制链接]

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硕士论文-水貂生长激素真核重组质粒构建及其表达的研究，共68页，35102字

摘 要

本试验旨在研究水貂生长激素的克隆与表达，探索出批量生产的途径和方

法。试验通过构建真核表达质粒pPIC9K-mGH，转化到巴斯德毕赤酵母GS115，

利用含不同浓度G418（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml）的YPD平板进一步

筛选多拷贝重组子。将多拷贝重组子用BMGY富集菌株，并用BMMY诱导表达

蛋白，每隔 24h取样一次并添加甲醇，使其终浓度为 1%。将取得的菌样，离心

取上清，TCA浓缩并进行SDS-PAGE和Western blot检测；通过构建真核表达质粒

pVAX1-mGH，利用LipofectamineTM 2000 转染到BHK-21 细胞中，用最小致死量

为 300μg/ml的G418 进行阳性细胞株的筛选，进行免疫细胞化学和ELISA检测蛋

白表达情况。本试验还将阳性重组质粒pVAX1-mGH注射到小鼠后肢的股四头肌，

分别于注射后 5、10、20、40、60d眼球采血，ELISA检测血清中mGH的含量，

同时取注射部位的肌肉组织进行免疫组织化学检测。试验结果如下：

1.重组质粒 pPIC9K-mGH 转化到巴斯德毕赤酵母 GS115 中，经含 4.00 mg/ml

G418 的 YPD 平板筛选出高拷贝细胞株，用 SDS-PAGE 检测 mGH 的表达。结果

显示，用 1%甲醇连续诱导 3d 后，目的蛋白的表达最多；Western blot 鉴定表明

目的蛋白在酵母中获得了表达。

2. 重组质粒 pVAX1-mGH 转染到哺乳动物 BHK-21 细胞中，经 G418 筛选

出阳性细胞株，免疫组化检测到目的蛋白在 BHK-21 细胞中获得了表达；ELISA

检测到目的蛋白具有较好的免疫原性，且转染后 48h，目的蛋白的表达量最多。

3. 重组质粒 pVAX1-mGH 注射到小鼠后肢的股四头肌后 40d，血清中目的蛋

白的含量最多，且 ELISA 检测到目的蛋白具有较好的免疫原性。免疫组织化学

检测到了特异性的目的蛋白，说明 mGH 在小鼠的肌纤维中得到了表达。

关键词：水貂；生长激素；表达；Western blot；ELISA；免疫组织化学

目录

中文摘要 1

英文摘要 2

缩略符号 ...............Ⅰ

文献综述 1

1 前言 .... 1

2 GH 的生理调控.... 1

3 生长激素的生物学功能 ...... 1

3.1 促进生长作用 .. 2

3.2 促进代谢作用 .. 2

3.3 GH 对内分泌腺体的作用.. 2

3.4 GH 对生殖功能的作用...... 2

4 GH 的基因表达.... 3

5 GHR 及其信号转导分子 ...... 3

6 生长激素的制备工艺 .......... 4

7 生长激素的使用方法 .......... 4

7.1 制成缓冲剂——注射法 ... 4

7.2 制成缓释剂——埋植法 ... 4

7.3 免疫法 .............. 4

8 真核表达系统 ..... 5

8.1 酵母表达系统 .. 5

8.2 昆虫细胞表达系统 ........... 6

8.3 哺乳动物细胞表达系统 ... 6

9 我国在生长激素方面的研究进展........ 7

10 生长激素的临床应用 ........ 8

11 水貂生长激素的临床应用. 8

研究内容

试验一 pPIC9K-mGH 真核重组质粒的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达 ..... 10

1 试验材料 ........... 10

1.1 质粒和菌株 .... 10

1.2 试剂 ................ 11

1.3 仪器设备 ........ 11

2 试验方法 ........... 11

2.1 人工合成水貂生长激素 . 11

2.2 引物的设计与合成 ......... 11

2.3 PMD-mGH 质粒的大量提取............ 12

2.4 pPIC9K-mGH 重组质粒的构建 ....... 13

2.5 重组质粒对巴斯德毕赤酵母 GS115 的转化.... 15

2.6 阳性转化子的抗性筛选和鉴定........ 16

2.7 重组基因工程酵母菌的诱导表达.... 17

3 结果 .. 19

3.1 重组质粒的构建及鉴定 . 19

3.2 重组质粒 pPIC9K-mGH 的菌液 PCR.............. 21

3.3 重组质粒 pPIC9K-mGH 的双酶切鉴定 .......... 21

3.4 PCR 鉴定 pPIC9K-mGH 是否整合到酵母 GS115 基因组 ................ 22

3.5 多拷贝酵母菌转化子的筛选........... 23

3.6 mGH 在酵母表达产物的 SDS-PAGE 检测 ...... 23

3.7 表达产物的 Western blot 鉴定 ......... 24

4 讨论 .. 24

4.1 表达系统的筛选 .............. 24

4.2 发酵条件的优化 ............. 25

4.3 防止目的蛋白降解 ......... 25

试验二 pVAX1-mGH 重组质粒的构建及在 BHK-21 细胞、小鼠肌肉组织的表达 ............ 26

1 试验材料 ........... 26

1.1 试验动物 ........ 26

1.2 质粒、细胞与菌株 ......... 26

1.3 试剂 ................ 26

1.4 仪器设备 ........ 26

2 试验方法 ........... 27

2.1 人工合成水貂生长激素 . 27

2.2 引物的设计与合成 ......... 27

2.3 pVAX1-mGH 重组质粒的构建 ........ 27

2.4 细胞培养 ........ 28

2.5 转染用重组质粒的制备 . 28

2.6 重组质粒转染 BHK-21 细胞及表达产物的检测 ............. 28

2.7 重组质粒在小鼠骨骼肌中的表达及产物的检测............. 30

2.8 数据处理 ......... 33

3 结果 .. 33

3.1 重组质粒的构建及鉴定 . 33

3.2 pVAX1-mGH 在 BHK-21 细胞中的表达 ......... 36

3.3 免疫组化检测小鼠注射质粒部位骨骼肌中 mGH 的表达 ............... 37

3.4 ELISA 检测小鼠血清中 mGH 的含量 ............. 37

4 讨论 .. 38

结论 ............... 40

参考文献 ............... 41

致谢 ...... 46

附录 47

攻读硕士学位期间发表的学术论文 ..... 54

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