[硕士论文] 昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及鉴定试验 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及鉴定试验，共63页，35323字

摘 要

目的：

对胚胎干细胞（ESC）分离培养的研究，旨在摸索适合昆明小鼠 ESC 分离培养的方

法，以提高昆明小鼠 ESC 的建系率。

方法：

本试验分为两部分：饲养层的制备以及 KMmESC 的分离培养。饲养层包括 MEF 饲

养层和 bBMSC 饲养层。对 MEF 饲养层的制备采用两种方法：先消化离心，长满后采

用 MMC 处理，然后用 PBS-清洗后用做饲养层；另一种方法是 MMC 处理后，消化离心

接种贴壁后做饲养层。bBMSC 饲养层采用长满后用 MMC 处理 0h、0.5h、1h、1.5h、2h、

2.5h，选取合适的处理时间段，PBS-清洗后直接用做饲养层，并比较了 MEF 饲养层与

最佳时间段处理的 bBMSC 饲养层用做分离 ESC 的效果。

在试验中选用了三种不同发育阶段的胚胎（桑葚胚、囊胚和孵化囊胚）来进行分离

培养 ESC，并比较了初步增殖 ICM 与完全增殖 ICM 对 ESC 分离培养的效果。选取三种

胰酶 +EDTA 组合（ 0.25%胰酶 -0.04%EDTA、 0.20%胰酶-0.04%EDTA 和 0.02%胰酶

-0.04%EDTA），选取较好效果的酶浓度，然后分别采用机械分离、一次消化法、连续消

化法、连同饲养层一起消化法以及机械分离+酶消化法五种方法分离 ICM 和 ESC 集落，

比较五种方法对昆明小鼠 ESC 分离培养的影响。并且对分离筛选的 ESC 集落进行碱性

磷酸酶（AKP）检测、核型分析和体外分化潜能的检验。

结果：

1 丝裂霉素 C（MMC）处理 bBMSC1h、1.5h、2h 时效果较好，三个时间点无明显差

异（P>0.0 5）。小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）作为饲养层细胞时与 bBMSC 作为饲养层

细胞时获得 5 代 ESC 的效果相比差异不显著（P>0.05）。

2 采用 0.02%胰酶-0.04%EDTA 消化的第二代 ESC 克隆率最高，所传代数最高，效果

较好，适合用于分离培养 ESC。

3 0.02%胰酶-0.04%EDTA 浓度下，采用连续消化法对 ESC 进行传代的效果最好，传

至 5 代的效率最高。

4 贴壁后初步增殖（贴壁后 24h）的 ICM 与贴壁后充分增殖（贴壁后 72-96h）的 ICM

在获得 ICM 率方面、分离昆明 ESC 的效果方面差异显著。早期增殖 ICM（94.6%，21.6%）

要显著高于充分增殖的 ICM（81.3%，10.4%）。

5 不同发育阶段的胚胎对 ESC 分离培养有很大的影响。孵化囊胚的与囊胚和桑葚胚

相比差异显著。

6 ESC 之间能够相互附着，具有自发形成 ES 集落的能力。

7 所得 ES 集落 AKP 检测呈阳性，核型正常，能够分化为多种类型的细胞。

关键词：KM mESC; 分离培养;

MEF; 鉴定

目 录

中文摘要……………….……… …………...1

英文摘要……………….……… …………...3

缩略符号………………..………………..….5

文献综述…….................1

1 ESC 的基本特性…….1

2 维持 ESC 自我更新、全能性、永久性的分子机制…….… ..2

3 ESC 的建立…………….………….…...………………….…...5

4 ESC 的分离培养………………….………7

5 ESC 的鉴定方法.…....8

6 影响 ESC 建系的因素…………….……..10

7 应用前景……….…...12

第一部分 饲养层的制备…………….……15

1 材料和方法….….….15

1.1 试验材料….……...15

1.1.1 试验动物.……….15

1.1.2 主要试剂及仪器……………….…….15

1.1.3 溶液配置方法………………….…….15

1.2 试验方法….……....15

1.2.1 MEF 饲养层的制备…….…………....15

1.2.2 bBMSC 饲养层的制备方法………... 17

2 结果与分析…………18

2.1 饲养层的制备结果……………….. …..18

2.1.1MEF 饲养层的制备结果……………..18

2.1.2 bBMSC 饲养层的制备结果…………19

2.2 讨论……………….21

第二部分 小鼠 ESC 的分离培养及鉴定...23

1 材料和方法………...23

1.1 材料………………23

1.1.1 实验动物……......23

1.1.2 主要试剂及仪器..23

1.1.3 基本溶液的配制………………….….23

1.1.4 ESC 培养液………..……...................23

1.1.5 检胚管及消化管的制作……….…....23

1.2 试验方法…………23

1.2.1 母鼠的超排处理.23

1.2.2 胚胎的获得及孵化………………….23

1.2.3 ESC 的分离培养.24

1.2.4 ESC 的鉴定…….24

2 结果与讨论………...25

2.1 结果………………25

2.1.1 昆明小鼠胚胎 ICM 的生长行为……25

2.1.2 形态学观察及 AKP 染色……………26

2.1.3 ESC 的核型分析鉴定……………….27

2.1.4 消化液浓度对昆明 ESC 的影响……………….………..27

2.1.5 消化方法对昆明 ESC 分离培养的影响……….………..28

2.1.6 MMC 处理 BMSCs 对 ICM 形成率的影响……….……29

2.1.7 不同饲养层对昆明小鼠 ESC 培养的影响………….......29

2.1.8 两种不同时期 ICM 对昆明小鼠 ESC 培养的影响………………...………..30

2.1.9 不同时期胚胎对昆明小鼠 ESC 培养的影响…………...30

2.1.10 ESC 自发形成典型集落.………….31

2.1.11 ESC 体外分化 ………………......31

2.2 讨论………….….32

结论………………….36

参考文献…………….37

附录………………….41

致谢………………….49

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