[硕士论文] 人lactoferrin转基因动物生物反应器模型的研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-人lactoferrin转基因动物生物反应器模型的研究，共66页，40699字

摘要

利用转基因动物乳腺生物反应器生产重组蛋白是当今生物技术研究的热点之一。然

而，在转基因动物出生之前，重组蛋白能否在转基因动物乳腺细胞中有效表达还很难确

认。鉴于此，本研究的目的在于建立了一种简单而有效的转基因方法，用于评估外源蛋

白在转基因动物乳腺组织中的特异表达并利用可以有效表达外源基因的转基因载体对

山羊体细胞进行体外转染，获得转基因体细胞后进行核移植以期获得转基因克隆胚胎。

本研究克隆了人乳铁蛋白基因（lactoferrin，LF）cDNA，利用山羊 β-casein 基因 5’

端调控序列来指导人乳铁蛋白基因的乳腺组织特异性表达，从而构建了转基因表达载体

pGBC2LF。利用绿色荧光蛋白基因（EGFP）作为标记基因，借助家兔精子与 EGFP 基

因的共转染和体外受精技术，研究了家兔精子结合与转运外源基因的能力，利用转基因

阳性胚胎比例系统地比较了外源 DNA 浓度、DMSO 浓度、线性化和环化 DNA 的比例

等 对 家 兔 精 子 介 导 基 因 转 移 效 率 的 影 响 。 利 用 DMSO- 精 子 介 导 基 因 转 移 技 术

（DMSO-SMGT）获得 89 只 LF 转基因家兔，其中 46 只为阳性（51.7％），21 只转基因

雌性家兔中有 17 只（81％）在乳腺组织中能特异表达人乳铁蛋白。这一实验表明，利

用 DMSO-SMGT 技术能够生产转基因家兔，并且人乳铁蛋白能够在家兔乳腺组织中特

异表达。

将含有人 lactoferrin 基因和 neo 基因的乳腺表达载体 pGBC2LF 线性化后，利用脂

质体介导外源基因体外转染了奶山羊胎儿成纤维细胞，经过 G418 药物抗性筛选后获得

了稳定整合人 lactoferrin 基因的转基因体细胞克隆 17 个，其中 PCR 和 Southern Blot 检

测阳性的转基因细胞克隆 14 个，阳性率 82.4％。以 LF3 和 LF20 两株转基因体细胞克

隆细胞为供体细胞，以超数排卵获得的卵母细胞或屠宰山羊来源的体外成熟的卵母细胞

作受体细胞进行了核移植，获得了能够体外早期发育的山羊转基因克隆胚胎。不同转基

因细胞系之间的核移植效率差异不显著；而体内成熟卵母细胞作受体的核移植囊胚率为

64.8％，体外成熟卵母细胞作受体的核移植囊胚率为 51.7％，差异显著（p<0.05）。该研

究证明了山羊转基因体细胞能够支持克隆胚胎的早期发育。

关键词

人 lactoferrin 基因；精子介导基因转移；核移植；兔；山羊；乳腺生物反应器

中文摘要

英文摘要

目录

前言

文献综述

第一部分

转基因动物乳腺生物反应器的研究现状与发展前景

用于制备转基因动物乳腺生物反应器的物种的优缺点

制备转基因动物的方法

精子载体法

精子结合外源DNA的分子机制

精子整合外源DNA的分子机制

外源DNA在精细胞内的存在与降解

精子介导制备转基因动物的研究进展

转基因体细胞的核移植

不同物种的克隆

遗传背景对核移植的影响

核移植步骤对其效率的影响

卵母细胞去核

卵母细胞的激活

供受体细胞间的细胞周期同步化

克隆胚的体外培养

核移植胚胎基因组的重编程影响核移植效率

借助核移植技术进行的遗传操作

转基因动物的检测

DNA水平的检测

RNA 水平的检测

目的蛋白的检测

转基因动物乳腺生物反应器的应用与发展前景

动物乳腺生物反应器的概念

动物乳腺生物反应器的应用与发展前景

实验研究

第二部分

hLF乳腺特异表达载体构建和转基因家兔制备

材料与方法

材料

菌株和质粒

培养基

工具酶与试剂

引物合成与基因测序

实验动物

主要仪器

主要溶液

方法

提取质粒

切胶回收

DNA的限制性酶切与外源DNA与质粒载体的连接反应

pGBC5 的克隆与序列分析

LF基因cDNA的克隆与序列分析

乳腺表达载体pGBC2LF构建

家兔精子的体外转染与体外受精

DMSO-睾丸介导制备转基因家兔

转基因兔的PCR和Southern blot检测

1.2.10 LF的ELISA检测

1.2.11 统计学分析

结果与分析

人LF基因cDNA和山羊β-casein基因 5’调控序列的克隆与分析

pGBC2LF载体的构建与鉴定

家兔精子的外源基因转染与体外受精

DMSO-睾丸介导制备转基因家兔

讨论

乳腺表达载体的构件及目的蛋白的选择

精子介导的基因转移

精子介导基因转移的影响因素

小结

第三部分

山羊体细胞的外源基因转染与转基因体细胞核移植

材料与方法

材料

培养液和细胞因子

细胞与胚胎培养系统

工具酶与试剂盒

方法

大量提取表达质粒pGBC2LF

表达载体pGBC2LF转染山羊胎儿成纤维细胞

阳性细胞克隆的挑取

阳性细胞克隆DNA的制备

PCR和Southern blot检测阳性细胞克隆

山羊卵母细胞的收集与体外培养

山羊卵母细胞的体外培养

山羊体细胞的核移植

核移植胚的激活与体外培养

统计学分析

结果与分析

外源基因转染山羊胎儿成纤维细胞

阳性细胞克隆的检测与染色体核型分析

山羊卵母细胞的体外培养与核移植

讨论

体细胞的外源基因转染及其影响因素

转基因体细胞的核移植及其影响因素

小结

第四部分

参考文献

结论

致谢

个人简历

资料文件预览：
共1文件夹，1个文件，文件总大小：1.90MB，压缩后大小：608.64KB

• 硕士论文-人lactoferrin转基因动物生物反应器模型的研究
• 硕士论文-人lactoferrin转基因动物生物反应器模型的研究.doc  [1.90MB]