[硕士论文] 猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及DNA疫苗的初步研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及DNA疫苗的初步研究，共63页，34065字

摘要

1.本研究采集 PRRS 疑似病料，在 Marc-145 细胞上进行病毒分离，盲传 3 代，出现

细胞病变。根据 GenBank 中 PRRSV 美洲株保守 N 基因序列设计合成了一对引物，利用

RT-PCR 方法从分离毒株细胞培养物中扩增出大小约 374bp 片段。病毒在 Marc-145 细胞

上培养 36h 后做免疫荧光试验（IFA），出现明显的绿色荧光。证明分离到一株 PRRSV 毒

株。

2.根据 GenBank 数据库中的 PRRSV VR2332 毒株 GP5 的基因序列，设计合成了两对

引物，针对 GP5 蛋白的含有 BamHI 和 EcoRI 酶切位点的引物 p1/p2 和针对 GP5 蛋白非中

和表位缺失含有 HindIII、EcoRI 酶切位点的引物 tGP5.1/tGP5.2，RT-PCR 扩增 GP5 基

因和 tGP5 基因的 DNA 序列，克隆于真核表达载体 pcDNA3.1 中，经 PCR、酶切鉴定及 DNA

序列测定，表明插入的片段具有正确的阅读框，同时证明分离毒株为美洲株。

3. pcDNA3.1、真核重组质粒 pcDNA3.1-GP5 和 pcDNA3.1-tGP5 用 Lipofectamine2000

转染 Marc-145，于 37℃ 5%CO2 培养细胞 48h，提取总 RNA 做 RT-PCR，结果 pcDNA3.1-GP5

转染孔在 603bp 处出现目的条带，pcDNA3.1-tGP5 转染孔在 495bp 处出现目的条带，表

明两个重组质粒在细胞中得到转录。同时对转染孔做免疫荧光试验，转染 pcDNA3.1-GP5、

pcDNA3.1-tGP5 质粒的细胞均出现明显荧光，证明重组质粒在 Marc-145 中得到有效表

达。

4. 用 TIANGEN 公司质粒大提试剂盒大提质粒 pcDNA3.1-GP5,pcDNA3.1-tGP5 和空载

体 pcDNA3.1，将三种质粒及 PBS 免疫小鼠 4 次，每次间隔 2 周，每次免疫后两周用 ELISA、

病毒中和试验检测抗 PRRSV 抗体。结果表明 pCDNA3.1-GP5 和 pCDNA3.1-tGP5 均能在小

鼠体内有效诱导 ELISA 抗体和中和抗体，从而为进一步发展有效的疫苗、为 PRRS 的防

制提供了一定的指导意义。

关键词：PRRSV；病毒分离；GP5；中和表位

目录

摘要........I

ABSTRACT........... II

符号说明.III

前言....... 1

第一部分 文献综述 2

1 PRRSV 的流行病学研究 .......... 2

2 PRRSV 分子生物学研究 ........... 4

3 免疫学的研究............. 9

4.中和抗体在 PRRSV 保护性免疫中的作用 .......... 10

5 预防 PRRSV 感染的疫苗研究 11

第二部分 试验研究............. 13

试验一 猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定............ 13

1.试验材料..... 13

2.方法............. 13

3.结果与分析. 16

4 讨论............ 18

试验二 PRRSV GP5 与 tGP5 基因克隆及其真核表达载体的构建 ........... 20

1.试验材料..... 20

2.方法............. 20

3.结果............. 25

4 讨论............ 29

试验三 pcDNA3.1-GP5 和 pcDNA3.1-tGP5 在 Marc-145 细胞中的表达 .............. 30

1.材料............. 30

2 方法............ 30

3.结果............. 33

4.讨论............. 35

试验四 PRRSV GP5 蛋白非中和性表位缺失对其免疫应答的影响 ......... 36

1.试验材料..... 36

2.方法............. 36

3 结果............ 39

4 讨论............. 41

全 文 总 结.......... 43

参考文献. 44

附 录

溶液的配制............. 50

致谢......... 53

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• 硕士论文-猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及DNA疫苗的初步研究
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