[硕士论文] 枯草芽孢杆菌pgsA与猪传染性胃肠炎病毒Sa融合基因的原核表达 [复制链接]

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硕士论文-枯草芽孢杆菌pgsA与猪传染性胃肠炎病毒Sa融合基因的原核表达，共68页，34649字

摘 要

1.根据 GenBank 中已发表的枯草芽孢杆菌 pgsA 基因序列，设计合成了一对能扩增

1155bp 基因片段的引物，引物两端分别有 KpnⅠ和 BamHⅠ的酶切位点。以枯草芽孢杆

菌染色体 DNA 为模板，经 PCR 扩增得到目的片段，然后将其克隆到 pMD18-T 载体上，

经蓝白斑筛选和酶切鉴定选择阳性克隆进行序列测定，构建成功的重组质粒命名为

pMD18-T-pgsA。用 DNAstar 软件将其与 GenBank 上的 pgsA 序列进行同源性比较，结

果表明核苷酸同源性在 90%以上，氨基酸同源性 94%以上。核苷酸序列系统进化树分

析，发现该试验株与浙江株亲缘关系最近。经 ProtScale 软件分析表明：该基因所编码

蛋白在靠近其 N 端存在一个跨膜区，为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗

的研制奠定了一定的基础。

2.将猪传染性胃肠炎病毒接种 ST 细胞进行增殖，待细胞出现明显的病变后，将细胞反

复冻融三次收获病毒。根据 GenBank 中已发表的猪传染性胃肠炎病毒 S 基因的序列，

设计合成了一对扩增 S 基因包含 A 抗原位点 724bp 基因片段(Sa)的引物，引物两端分别

有 BamHⅠ和 HindⅢ的酶切位点。以感染细胞提取的病毒 RNA 为模板，经 RT-PCR 扩

增得到目的片段，然后将其克隆到 pMD18-T 载体上，经蓝白斑筛选和酶切鉴定选择阳

性克隆进行序列测定，构建成功的重组质粒命名为 pMD18-T-Sa。用 DNAstar 软件将其

与 GenBank 上的序列进行同源性比较，结果表明核苷酸同源性为 97%以上，氨基酸同

源性为 93%以上。根据猪传染性胃肠炎病毒 Sa 基因核苷酸序列绘制的系统进化树，结

果表明，试验株与 TH-98 株亲缘性最近。

3.对克隆载体 pMD18-T-pgsA 做 KpnⅠ和 BamHⅠ的双酶切，将所得片段插入表达载体

pET-32a(+)，构建了重组质粒 pET-pgsA，对克隆载体 pMD18-T-Sa 和重组质粒 pET-pgsA

分别做 BamHⅠ和 HindⅢ双酶切，将 Sa 片段插入到 pET-pgsA 中，构建重组质粒

pET-pgsA-Sa。重组质粒经 PCR 和酶切鉴定为阳性后，转化入宿主菌 E.coli BL21(DE3)

中，IPTG 诱导表达，经 SDS-PAGE 电泳分析表明，在 70kDa 处出现了与预期大小相符

的目的条带。摸索最佳诱导条件(25℃,IPTG 1mM/L,220r/min 诱导 5h)，经 Western-blot

试验进一步证实，融合基因 pgsA-Sa 获得正确表达，具有良好的反应原性。间接免疫荧

光试验初步证实融合蛋白在大肠杆菌表面获得了表达。

关键词：枯草芽孢杆菌；pgsA 基因；猪传染性胃肠炎病毒；Sa 基因；克隆；序列

分析；原核表达

目录

中文摘要………………

英文摘要………………

缩略符号………………

前言……………………

第一部分 文献综述…

1 TGEV 基因组结构和功能……………………

2 TGE 发病机制………

3 TGEV 疫苗的研制…

4 疫苗和黏膜免疫……

5 细胞表面呈现系统的研究……………………

第二部分 试验内容…

1 枯草芽孢杆菌 pgsA 基因的克隆及序列分析

1.1 材料与方法………

1.2 结果与分析………

1.3 讨论………………

2 猪传染性胃肠炎病毒 Sa 基因的克隆与序列分析………………………

2.1 材料与方法………

2.2 结果与分析………

2.3 讨论………………

3 融合基因 pgsA-Sa 原核表达载体的构建及其表达……………………

3.1 材料与方法………

3.2 结果与分析………

3.3 讨论………………

全文总结 ……………

参考文献………………

致谢……………………

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