[硕士论文] 猪伪狂犬病病毒gE基因核酸探针的制备及应用 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-猪伪狂犬病病毒gE基因核酸探针的制备及应用，共64页，41374字

摘 要

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）又称Aujeszky氏病,是由伪狂犬病病毒引起的猪、

牛、 羊等多种家畜、家禽及野生动物的一种以发热、奇痒（猪一般除外）、呼吸和神

经系统疾病为特征的重要传染病。在根除伪狂犬病的过程中，疫苗扮演了重要的角色。

在各种疫苗中基因缺失疫苗是应用最广泛的，目前商业化基因缺失疫苗普遍缺失了gE基

因，甚至立法规定只允许gE(gI)基因缺失疫苗使用。本试验根据我国目前广泛使用的伪

狂犬疫苗大多缺失gE基因这一特性，克隆了PRV-S株gE基因的部分序列，分析了序列的

结构、同源性，对PRV-S株gE基因的部分序列进行了PCR扩增，并用地高辛将扩增产物标

记制成核酸探针，用制备的核酸探针进行了临床病料的检测。通过一系列试验，本试验

取得如下的成果：

1.根据 GenBank 收录的 PRV-Min-A 株(登录号为 AY170318)、PRV-LA 株(登录号为

AY173124)、PRV-Ea 株（登录号为 AF171937）、Korea 株（登录号为 AY249861）及 AF207700

株的 gE 基因保守序列设计一对引物，运用 PCR 方法从 PRV-S 株基因组中克隆了 304bp

的 gE 基因 DNA 部分序列。该序列与以上五株不同地域的野毒 gE 基因序列经 DNAStar 软

件比较后发现核苷酸序列的同源性均在 98%以上，说明该片段可用于制备核酸探针来检

测猪伪狂犬病野毒感染。

2.以含有 gE 基因部分序列的重组质粒为模板进行了 PCR 扩增，扩增产物经地高辛

标记后制成 gE 基因核酸探针。特异性检测该探针只与 PRV-S 株 DNA 有阳性反应，而与

PRVBartha-k61 株疫苗毒 DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA 反应均为阴

性，说明该核酸探针具有良好的特异性。敏感性检测说明该探针至少可检测到 4pg 的 DNA

片段，具有较好的敏感性。

3.用制备的 gE 基因核酸探针对临床采集的 32 份猪繁殖障碍病料进行了斑点杂交检

测，结果 4 份病料呈现阳性反应。而同时用针对 gE 基因设计的引物对 32 份病料进行 PCR

检测，也检出 4 份阳性病料，且这四份阳性病料的编号一致，PRV 的野毒感染率为 12.5%，

二种方法的符合率为 100%，说明该核酸探针可以作为一种临床检测猪伪狂犬病野毒感染

的分子生物学方法。

关键词：猪伪狂犬病毒；gE 基因；地高辛标记探针；斑点杂交；野毒株

目录

中文摘要……1

英文摘要……2

英文缩写词表3

前言…………4

文献综述……6

试验一 猪伪狂犬病病毒 gE 基因部分片段的克隆………22

1 试验材料…22

2 试验方法…22

3 结果与分析28

4 讨论………30

试验二 猪伪狂犬病病毒 gE 基因核酸探针的制备………32

1 试验材料32

2 试验方法32

3 结果与分析……………………35

4 讨论 ……36

试验三 临床病料的检测 …………39

1 试验材料 ……… …………… ……… ………39

2 试验方法39

3 结果与分析……………………41

4 讨论 ……42

全文结论……45

参考文献……46

附录…………53

致谢…………57

攻读硕士期间发表的论文…………58

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