[硕士论文] 热应激对体外小鼠早期囊胚发育能力及超微结构影响的研究 [复制链接]

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硕士论文-热应激对体外小鼠早期囊胚发育能力及超微结构影响的研究，共65页，32274字

摘 要

以雌性昆明种小鼠为试验动物，经 PMSG-hCG 超数排卵后，收集受精卵，进行体

外培养。当胚胎发育至早期囊胚时，按照下列方式处理：（1）将体外培养至早期囊胚的

小鼠胚胎分别施以温和热应激（39℃，2h）和强烈热应激处理（41℃，2h），热应激结

束后在 37℃下继续培养；对照组在 37℃下连续培养。在体视显微镜下观察热应激后 24h

时早期囊胚发育到扩张囊胚的比率和热应激后 48h 时早期囊胚发育到孵化囊胚的比率；

利用早期胚胎总细胞计数法，统计热应激后 24h 时早期囊胚发育到扩张囊胚的平均总细

胞数及热应激后 48h 时早期囊胚发育到孵化囊胚的平均总细胞数。 2）将体外培养至早

期囊胚的小鼠胚胎分别施以温和热应激（39℃，2h）和强烈热应激（41℃，2h）处理，

分别在热应激后 0h 和 2h 时，收集胚胎，制作超薄切片；对照组胚胎处理方式同热应激

组。利用电子显微镜技术，观察不同强度热应激组和对照组胚胎及热应激后胚胎不经恢

复和恢复 2h 时的超微结构变化。试验结果如下：

1. 热应激对小鼠早期囊胚发育能力的影响

体外培养的小鼠早期囊胚在 41℃、6%CO2条件下热应激处理 2h，小鼠早期囊胚发

育到扩张囊胚（63.3±3.6%）和孵化囊胚（49.4±9.3%）的比率显著降低（P<0.05），而

在 39℃、5.5%CO2条件下热应激处理 2h的小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚（80.8±6.4%）

和孵化囊胚（79.7±5.6%）的比率与对照组小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚（81.7±6.5%）

和孵化囊胚（77.2±5.0%）的比率差异不显著（P>0.05）。与对照组小鼠早期囊胚发育到

扩张囊胚的平均总细胞数（57.11±1.7）相比，39℃热应激组（49.89±1.3）和 41℃热应

激组（42.22±2.0）小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚的平均总细胞数均显著降低（P<0.05），

但 39℃热应激组（71.27±0.5）和 41℃热应激组（71.89±1.8）小鼠早期囊胚发育到孵化

囊胚的平均总细胞数与对照组（73.09±0.6）小鼠早期囊胚发育到孵化囊胚的平均总细胞

数之间差异不显著（P>0.05）。

2. 热应激对小鼠早期囊胚超微结构形态的影响

在 37℃正常培养的小鼠早期囊胚中，胞浆含有丰富的线粒体和内质网及少量的溶

酶体；粗面内质网上有大量的颗粒状的核糖体附着；细胞核内以常染色质为主，核仁大

而松散；细胞连接紧密、结构完整；卵周隙狭窄。

39℃热应激组小鼠早期囊胚的线粒体发生轻微肿胀，内质网略有扩张，部分核糖体

从粗面内质网上脱落；核周间隙稍有增大。经 37℃恢复培养 2h，上述异常细胞器已修

复。

41℃热应激组小鼠早期囊胚线粒体高度肿胀，粗面内质网上的核糖体脱落严重，滑

面内质网和溶酶体增多；卵周间隙和核周间隙明显增大；核仁的纤维部和颗粒部分离，

异染色质增多；桥粒连接结构被破坏，胞浆出现异常物质。热应激后经 37℃恢复培养

2h，损伤的细胞器没有得到修复。

以上结果说明，39℃温和热应激 2h 未对小鼠早期囊胚的发育能力和细胞器超微结

构形态产生明显的影响。41℃强烈热应激 2h 对小鼠早期囊胚发育具有明显的抑制作用，

并且损伤的胚胎难以从热应激中恢复。

关键词：热应激；小鼠；早期囊胚；发育能力；超微结构

目录

中文摘要 ......... 1

英文摘要 ......... 3

缩略符号 ....... Ⅰ

文献综述 ......... 1

1 前言 ............. 1

2 热应激对哺乳动物卵母细胞及早期胚胎发育能力的影响 ............... 1

2.1 热应激对卵母细胞成熟及受精过程的影响 1

2.2 热应激对附植前胚胎发育能力的影响 ........ 2

3 热应激抑制哺乳动物早期胚胎发育的作用机理 ............. 4

3.1 诱导氧化应激 ............ 4

3.2 促使细胞凋亡 ............ 4

3.3 阻碍有丝分裂 ............ 5

4 热休克蛋白 70 对细胞的保护作用 ................. 6

4.1 分子伴侣功能 ............ 7

4.2 诱导热耐受性 ............ 7

4.3 抑制细胞凋亡 ............ 7

4.4 抵抗氧化应激 ............ 8

4.5 参与细胞增殖 ............ 8

5 热应激对哺乳动物细胞器结构和功能的影响 ................. 8

5.1 热应激对细胞骨架的影响 .......... 9

5.2 热应激对线粒体的影响 .............. 9

5.3 热应激对细胞核的影响 ............ 10

5.4 热应激对核糖体、内质网、溶酶体及高尔基复合体的影响 ...... 10

试验一 热应激对小鼠早期囊胚发育能力的影响 ............. 12

1 试验材料 ... 12

1.1 试验动物 12

1.2 试验药品 12

1.3 试验器材 12

2 试验方法 ... 12

2.1 小鼠早期囊胚体外培养 ............ 13

2.2 胚胎细胞计数溶液配制 ............ 13

2.3 热应激处理 .............. 14

2.4 热应激后小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚和孵化囊胚的比率 ...... 14

2.5 热应激后小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚和孵化囊胚总细胞数 .. 14

2.6 数据统计 14

3 结果 ........... 14

3.1 热应激对小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚和孵化囊胚比率的影响 ................ 14

3.2 热应激对小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚和孵化囊胚总细胞数的影响 ........ 15

4 讨论 ........... 16

试验二 热应激对小鼠早期囊胚超微结构的影响 ............. 18

1 试验材料 ... 18

1.1 试验动物 18

1.2 试验药品 18

1.3 试验器材 18

2 试验方法 ... 18

2.1 小鼠早期囊胚体外培养 ............ 19

2.2 热应激处理 .............. 19

2.3 胚胎超薄切片药品配制 ............ 19

2.4 胚胎超薄切片制作 .. 20

2.5 图片处理 21

3 结果 ........... 21

3.1 热应激对小鼠早期囊胚线粒体的影响 ...... 21

3.2 热应激对小鼠早期囊胚溶酶体的影响 ...... 23

3.3 热应激对小鼠早期囊胚内质网的影响 ...... 25

3.4 热应激对小鼠早期囊胚细胞核的影响 ...... 26

3.5 热应激对小鼠早期囊胚细胞连接和卵周隙的影响 .... 28

3.6 热应激导致小鼠早期囊胚胞质产生异常物质 ............ 30

4 讨论 ........... 31

结论 ............... 34

参考文献 ....... 35

致谢 ............... 45

附录 ............... 46

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