[硕士论文] 抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备和竞争ELISA方法的建立 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备和竞争ELISA方法的建立，共53页，33104字

摘 要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）是猪 Glasser’s 病的病原菌，临床上以

纤维蛋白性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。Hps 是属于巴斯德菌科嗜血杆菌属

的一种不运动、NAD 依赖型、革兰氏阴性细小杆菌。近年来，随着我国规模化养猪场

的发展，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加

的重要原因之一，并给养猪业造成重大经济损失。本文研制了抗副猪嗜血杆菌的单克隆

抗体，并根据单抗建立了间接竞争 ELISA 的检测方法，对副猪嗜血杆菌的诊断和防制

具有重要意义。

本文分为两部分。第一部分是抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备及其生物学特性

鉴定，第二部分是应用单抗建立间接竞争 ELISA 的试验方法并对其反应条件进行优化。

以纯化的 SW124 全菌体免疫 Balb/c 小鼠，取脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合，将

提纯的外膜蛋白作为筛选抗原包被酶标板，经间接 ELISA 筛选，有限稀释法 3 次克隆，

获得了 3 株稳定分泌 Hps 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 2C6、4F10 和 5B9。

3 株单抗经亚类鉴定试剂盒测定，所产生抗体均为 IgG2b 型，腹水 ELISA 效价分别为

1:3200，1:12800 和 1:5120。通过 Western-blot 证明 2C6、4F10 和 5B9 这三株单克隆抗

体均是针对 37kDa 外膜蛋白的单抗，这些单抗的获得为 Hps 的研究及快速诊断方法的

建立奠定了基础。

选择一株针对外膜蛋白且腹水效价较高的单抗（4F10）来建立快速检测 Hps 抗体

的间接竞争 ELISA 方法。腹水单抗经 PEG 沉淀法纯化后，蛋白含量为 4.16mg/mL。以

SW124 外膜蛋白为包被抗原，利用针对 SW124 外膜蛋白的单克隆抗体与 Hps 猪血清竞

争该抗原，建立间接竞争 ELISA 方法检测 Hps 抗体，优化的反应条件为：将 SW124 外

膜蛋白作 500 倍稀释后包被酶标板，单克隆抗体作 1:600 稀释，竞争反应时间为 1h，酶

标抗体的工作浓度为 1:5000 且作用时间也为 1h，底物作用时间为 10min，建立的间接

竞争 ELISA 的方法检测 Hps 抗体样品具有较高特异性、稳定性和重复性。与正向间接

血凝试剂盒的检测结果相比，符合率达到 89.3%，从而为 Hps 抗体检测提供了一种有用

的实验室诊断方法。

关键词：Hps；单克隆抗体；生物学特性；间接竞争 ELISA

目 录

摘 要. I

ABSTRACT.......... II

英文缩写词表..... III

前言 1

文献综述........... 2

1 病原学 ....... 2

2 临床表现及病理变化 ........ 8

3 感染动物模型 . 9

4 诊断 ........ 10

5 协同感染 .... 11

6 防制 ........ 12

7 小结........ 15

试验一 副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备与生物学特性的研究 .... 16

1 材料与方法.. 16

2 结果与分析.. 20

3 讨论........ 24

试验二 单抗竞争 ELISA 检测 Hps 抗体方法的建立. 26

1 材料与方法 .. 26

2 结果与分析.. 28

3 讨论 ........ 35

全文总结.......... 38

参考文献.......... 39

致谢........... 44

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