[硕士论文] 昆明小鼠饲养层的制备及ES细胞的分离培养试验 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-昆明小鼠饲养层的制备及ES细胞的分离培养试验，共84页，43439字

摘 要

目的：

通过对四种饲养层细胞的分离培养，筛选一种简单有效的饲养层制备方法，以及筛

选最佳的 KM mES 细胞培养体系。探讨 KM mES 细胞的最佳培养液以及消化液浓度，

并获得一定代数的 mES 细胞集落。

方法：

本试验分为两个部分：饲养层制备以及 KM mES 细胞的分离培养。饲养层包括：

MEF 饲养层、mUESCs 饲养层、mBMFCs 饲养层以及 mBMSCs 饲养层。

1 对四种饲养层细胞采用两种消化方式，一种是胰酶消化后，离心接种。第二种是

胰酶消化后，当细胞收缩变圆，将要浮起时，吸出消化液，用培养液洗涤后，制成细胞

悬液，接种。

2 采用三种方法制备 KM mES 细胞饲养层。第一种是不使用 MMC 处理；第二种是

使用 MMC 处理后，消化离心，重新接种；第三种是经过 MMC 处理后培养 2～3h，直

接投入使用。采用第一种方法制备 mBMFCs 饲养层以及 mBMSCs 饲养层；采用后两种

方法制备 MEF 饲养层和 mUESCs 饲养层。

3 采用饲养层和 LIF 联合使用，来分离培养小鼠 ES 细胞。将获得 3.5d 的胚胎直接

培养在饲养层培养体系中，使 ICM 自然孵化，来分离培养 KM mES 细胞。

4 比较了三种消化液浓度（0.02%胰酶-0.008%EDTA；0.20％胰酶＋0.04%EDTA；0.25

％胰酶＋0.05%EDTA）对 ES 细胞分离培养的影响。

5 在 KM mES 细胞培养中，探讨 H-DMEM、HS、LIF、2-ME、Insulin 对 KM mES

细胞体外培养的影响。

结论：

1 采用本试验改进细胞培养方法，分离得到了纯化的四种细胞，并采用本试验中改进的

饲养层制备方法，成功制备出四种细胞的饲养层，用于分离培养 ES 细胞，其中 mBMFCs

饲养层效果最好，mBMSCs 饲养层次之，MEF 饲养层再之，mUESCs 效果最差。

2 采用饲养层与 LIF 联合使用，从增殖 5d 的 ICM 分离出 KM mESC，传至第 5 代，AKP

染色阳性。

3 0.02%胰酶-0.008%EDTA 是 KM mESC 最佳消化液浓度

4 在本实验室条件条件下，得到 KM mESC 最佳的培养基（H-DMEM+15% FBS+1％

NEAA+5 ％ HS+106IU LIF+0.1mmol 2-ME+0.1mmol ITS+20μg/ml Insulin+103IU/ml

penicilin and phytomycin）。

关键词：KM mES 细胞；MEF 饲养层；mUESCs 饲养层；mBMFCs 饲养层；mBMSCs

饲养层；分离培养

目录

摘要...........I

英文摘要......III

英文缩略注释...V

前言...........1

ES 细胞分离培养的研究进展........4

试验内容.......19

1 饲养层的制备..19

1.1 小鼠胎儿成纤维细胞的制备.....19

1.1.1 材料与方法19

1.1.2 结果......21

1.1.3 讨论......22

1.2 骨髓源性成纤维细胞的制备.....23

1.2.1 材料与方法23

1.2.2 结果......24

1.2.3 讨论......25

1.3 子宫内膜基质细胞的制备.......26

1.3.1 材料与方法27

1.3.2 结果......27

1.3.3 讨论......28

1.4 骨髓间充质干细胞的制备......28

1.4.1 材料与方法29

1.4.2 结果......30

1.4.3 讨论......30

1.5 照片........32

2 胚胎干细胞的分离培养..........36

2.1 材料与方法..36

2.2 结果........37

2.3 讨论........43

2.4 照片........44

结论...........52

参考文献.......53

附录...........61

附录 A..........61

附录 B..........63

附录 C. ........66

致谢

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