[硕士论文] 犬瘟热病毒H基因克隆测序与原核表达 [复制链接]

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硕士论文-犬瘟热病毒H基因克隆测序与原核表达

摘 要

1．将犬瘟热病毒弱毒株接种 Vero 细胞观察细胞病变，将细胞反复冻融三次收获病

毒，并对病毒增殖纯化。根据 GenBank 中已发表犬瘟热病毒 Onderstepoort 弱毒株的附

着或血凝蛋白基因序列，设计合成了一对能扩增 1074bp 基因片段的引物，引物两端有

SalⅠ和 XhoⅠ酶切位点。以病毒 RNA 为模板，用 RT-PCR 方法，扩增出 1074bp H 基因。

将扩增得到的部分 H 基因克隆到 pMD18-T 载体上，经蓝白斑和酶切鉴定筛选出阳性克隆

进行序列测定，用 blast 工具将其与 GeneBank 上标准株代表毒株序列进行了比较。结

果表明：该基因与标准株代表毒株序列完全同源，同时与疫苗株 Onderstepoort、Convac

株和国内外 CDV 病毒分离株进行了序列分析和同源性比较。结果显示目前使用的 CDV 弱

毒疫苗株 H 基因的核苷酸和编码氨基酸与国内和日本犬瘟热病毒分离株同源性比较低，

与扬州分离株同源性为 90.6%，长春分离株为 91.3%，新疆分离株为 90.5%，日本分离株

D85755 为 91%；与 Onderstepoort、Convac 株、美国分离株 98-2666-2 同源性较高，分

别为 97.7%、97.2%、98.1%，与国内、日本分离株存在明显的差异。上述结果表明，CDV

在传代过程中由于受生态环境、不同动物之间互相传播等因素的影响，引起了野毒株的

变异，CDV 疫苗株不能对所有的 CDV 流行株产生有效的保护。

2．对克隆载体 pTH 做 SalⅠ和 XhoⅠ双酶切，将所得片段以正确阅读框架插入

pET-32a(+)载体，构建了重组质粒 pETH 。重组质粒经 PCR 和酶切鉴定为阳性后，转化

入宿主菌 E.coli BL21(DE3)。IPTG 诱导表达，经 SDS-PAGE 分析表明，在 64KD 处出现

了与预期大小相符目的条带。确定了最佳诱导表达条件，IPTG1.0mM、25℃、Amp 浓度

100μg/ ml 、诱导表达 6h。经 Western-blot 免疫印迹试验进一步证实，该基因获得了

正确表达。对表达蛋白做可溶性分析，证实该蛋白以沉淀包涵体形式存在，并对包涵体

进行纯化得到目的蛋白。

关键词：犬瘟热病毒；H 基因；克隆；原核表达

目录

中文摘要.........

英文摘要..........

前言....

文献综述..........

1.CDV 基因组结构和功能...........

2.CDV 的遗传变异.........

3.CDV 的感染机制与免疫机制...

4.疫苗的研制..

试验内容.........

1.犬瘟热病毒 H 基因的克隆及序列分析

1.1 材料...........

1.2 方法...........

1.3 结果...........

1.4 讨论...........

2.犬瘟热病毒 H 基因片段的原核表达与鉴定......

2.1 材料...........

2.2 方法...........

2.3 结果...........

2.4 讨论...........

全文总结..........

参考文献..........

附录....

致谢....

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