[硕士论文] 鹅热休克蛋白70的表达提纯与病毒复合物形成的研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-鹅热休克蛋白70的表达提纯与病毒复合物形成的研究，共65页，37782字

摘要

热休克蛋白 70(HSP70)作为一种重要的伴随细胞蛋白，能够参与细胞修复和抗应激

活动，对于细胞健康至关重要，同时它还是引导抗原进入 MHC I 类途径进而引发细胞

免疫的“细胞因子”和在异体间传递抗病毒和肿瘤细胞免疫力的重要介质，为细胞内病毒

感染及肿瘤的预防和治疗提供了可贵的解决途径，正为动植物医学和人类医学基础研究

人员所热切关注，成为当前免疫学研究领域的一个新的热点。

关于禽类热休克蛋白的研究文献极少，其中关于鹅的则尚未报道。禽类的 MHC 和

哺乳动物的 MHC 有很多差异，禽类 HSP70 是否能够参与对病毒的特异性免疫的问题，

至今还没有统一的结论，禽 HSP70 和抗热应激及抗病毒感染的关系还有待探讨。

为研究 HSP70 在热应激的特异性表达，组织中 HSP70 的分离纯化及其结合抗原肽

形成复合物的特性，设计此试验。选取 6w 的健康五龙鹅随机分为三组，第 1 组(对照组)

鹅不经热处理后宰杀，第 2 组(试验 1 组)鹅进行 1 次 43±1℃、5h 的急性热处理后立即

宰杀，第 3 组(试验 2 组)鹅进行 1 次 43±1℃、5h 的急性热处理后，在正常饲养条件下

恢复 12h 后宰杀。取血液，检测血清中多种酶的活性以及多种离子浓度的变化；取心脏，

做常规石蜡切片，以 SP 免疫组化法检测 HSP70 的表达；肝脏速冻后以备 HSP70 蛋白提

纯之用。比较 3 组鹅心脏 HSP70 表达的差异，同时对试验组肝脏中的 HSP70 进行分离

纯化，并进行鉴定。纯化后的 HSP70 和人工合成的乙肝病毒(HBV)前 S1 多肽在体外相

结合形成复合物，设计双特异抗体夹心法检测其复合物的形成。

研究结果表明：

1. 热应激前后血浆中多种生理生化指标的变化，反映了热应激对于机体的严重影

响。高热对多种血浆酶活力有明显的影响，导致 GPT、AKP、LDH 活性分别对照下降

42.37%，32.85%和 26.25%，差异极显著(p<0.01)，ACP 活性对照下降 20.00%，差异显

著(p<0.05)，GOT 活性两组差异不显著(p>0.05)；热应激对于血浆中多种离子浓度的含量

亦有明显的影响，致使 Ca、P、Na 和 K 浓度分别对照下降 22.04%，13.19%，20.72%和

30.91%，差异均显著(p<0.05)；血浆 pH 值差异不显著(p>0.05)，但从数值上看有所上升，

血液的碱性增加。

2. 通过免疫组化法检测对照组和试验组心脏切片中 HSP70 的表达，发现正常情况

下五龙鹅心肌组织中 HSP70 表达为阴性，阳性细胞率仅为 0.6%；而热应激状态下心肌

纤维中有广泛的 HSP70 阳性颗粒，血管壁上阳性颗粒尤为明显：应激后立即宰杀组中

HSP70 表达重点部位在核膜及其周围，阳性颗粒聚集成团块状或絮状，阳性细胞率为

76.0%，而恢复 12h 后的鹅只其心肌 HSP70 表达重点转移到胞膜周围，阳性颗粒聚集呈

长条状，阳性细胞率为 88.4%。两个试验组之间的阳性细胞率差异不显著(p>0.05)，但

试验 2 组的阳性细胞率相对要高。本试验暗示着 HSP70 和保护细胞免受应激伤害可能

有着密切的联系。

3. 本试验中自行设计了两套低值高效的低压层析流程，首次尝试从成分复杂的鹅肝

组织中分离纯化 HSP70，并对参考文献所述方法进行了完善和改进，摒弃了传统纯化方

式的高等仪器依赖性，改善其普及性。通过 Sephacryl S-300 初步分离，ConA-Agarose

亲和层析和 DEAE 离子交换层析的方式纯化蛋白得到 HSP70 纯化物，纯度达 85%以上，

蛋白得率为 0.115mg/g；通过 Sephacryl S-300 初步分离，ConA-Agrose 和 ADP-Agarose

亲和层析能得到目的蛋白纯化物，纯度达 95%，蛋白得率为 0.157mg/g；两种方式均可

有效分离目的蛋白，相比较而言，Sephacryl S-300初步分离，ConA-Agrose和 ADP-Agarose

亲和层析这套流程效果更好。Western Blot 证明两种方式所得蛋白均为 HSP70。

4. 人工合成 HBV 的 Pre S1 抗原中的主要抗原决定簇，作为半抗原和一定载体蛋白

相结合后免疫家兔，制备半抗原的特异性抗体；同时，合成肽在一定条件下与纯化所得

的 HSP70 在体外形成复合物，经所制备的多肽抗体和商品 HSP70 多克隆抗体通过双特

异性抗体夹心法检测复合物的形成，复合物效价为 1：81。说明在体外的一定条件下

HSP70 可与病毒多肽形成复合物。

以上试验从 HSP70 的表达、提纯和肽段结合特性等方面对鹅 HSP70 进行研究，探

索出在普通实验室条件下提取高纯度 HSP70 的方式方法，为广大普通实验室研究 HSP70

提供了技术借鉴，并且为进一步研究 HSP70 的免疫佐剂样效应提供了基础。与此同时，

HSP70 的免疫作用研究，也可为健全鹅抗病育种技术体系提供新的思路。

关键词：热应激，鹅，HSP70，表达，提纯，鉴定，病毒多肽，复合物形成

目 录

摘要……

英文摘要………………

中英文缩略词…………

前言……

文献综述……………

1 热休克蛋白的发现与分类………

2 HSP70 的结构及其作用机制………

3 HSP 70 的特性及其生物学功能……

4 HSP70 主要研究进展………………

研究内容…………

1 热应激对五龙鹅多项生理生化指标的影响……

1.1 引言………………

1.2 试验设计…………

1.2.1 试验设计………

1.2.2 方法……………

1.3 结果与分析………

1.3.1 肝脏蛋白总量的变化…………

1.3.2 高热对血浆多种生理生化指标的影响 ……

1.4 讨论………………

1.5 结论………………

2 五龙鹅心肌中 HSP70 的表达………

2.1 引言………………

2.2 试验设计…………

2.2.1 试验设计－热应激状态下 HSP70 在鹅心脏和肝脏中的表达………………

2.2.2 试验技术路线

2.3 材料和方法………

2.3.1 材料……………

2.3.2 方法……………

2.4 结果与分析………

2.4.1 热休克对组织形态结构的影响………………

2.4.2 热休克不同恢复期 HSP70 在组织中的定位…

2.5 讨论………………

2.6 结论………………

3 热休克状态下鹅肝脏中 HSP70 的分离提纯及其鉴定…

3.1 引言………………

3.2 试验设计…………

3.2.1 试验设计………

3.2.2 试验技术路线

3.3 材料和方法………

3.3.1 材料……………

3.3.2 方法……….……

3.4 结果与分析.……

3.4.1 第一套纯化方案 ………………

3.4.2 第二套纯化方案………………

3.4.3 Western Blot 鉴定纯化物……

3.5 讨论……………

3.6 结论………………

4 HSP70 与病毒多肽的体外结合………………

4.1 引言………………

4.2 试验设计…………

4.3 材料和方法………

4.3.1 试验材料………

4.3.2 测定指标及方法………………

4.4 结果与分析………

4.4.1 免疫血清检测结果……………

4.4.2 双特异抗体夹心法检测复合物形成…………

4.5 讨论………………

4.6 结论………………

全文总结………………

参考文献………………

致谢…

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• 硕士论文-鹅热休克蛋白70的表达提纯与病毒复合物形成的研究
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