[硕士论文] 花生与其近缘野生种体细胞杂交法的基础研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-花生与其近缘野生种体细胞杂交法的基础研究，共76页，32665字

摘要

花生是重要的油料兼经济作物，但由于花生易受多种病虫害以及干旱等灾害的

影响，导致其产量和品质严重下降。花生近缘野生种具有抗病、抗逆性强，生物产

量高，品质优良等遗传基因，但由于花生与其近缘野生种存在的种间杂交不亲和等

原因，严重限制了野生资源的有效利用。体细胞杂交法能够克服这种杂交不亲和

性，使野生种的利用成为可能。而体细胞杂交法能否成功应用依赖于高频率植株再

生体系的建立。本研究首先对花生及其近缘野生种组织培养植株再生方法进行研

究，建立了高频率植株再生体系，在此基础上对原生质体培养和细胞融合进行了研

究。

1. 对 33 个花生品种 (品系) 的不同外植体和利用不同培养基诱导不定芽分化及

植株再生进行研究，结果表明：(1) 基因型对再生率有很大的影响，不同基因型的不

定芽分化率有明显差异。(2) 花生不同外植体分化不定芽的频率有很大的差异，幼叶

明显优于上胚轴、下胚轴和子叶。 (3) 诱导培养基中添加 NAA 和 BAP 的浓度不同

对以后再分化培养基上不定芽分化有较大影响。 (4)对花生不定芽诱导的条件进行优

化，筛选出比较适合花生不定芽诱导分化及植株再生的培养基组合为：不定芽诱导

培养基为 MSB5+1mg/L NAA+6mg/L BAP+4mg/L AgNO3+600mg/L CH+ 3%蔗糖＋

0.8%琼脂；植株再生培养基为 MSB5 + 4mg/L BAP＋4mg/L AgNO3+600mg/L CH+

3%蔗糖＋0.8%琼脂；生根培养基为 MSB5 + 0.5mg/L NAA＋4mg/L AgNO3+600mg/L

CH +3% 蔗糖＋0.8%琼脂。

2. 对花生及其近缘野生种胚性愈伤组织和体胚诱导进行研究表明：野生种胚性

愈伤组织形成培养基为 MSB5+10mg/L 2,4 D +4mg/L AgNO3+600mg/L CH +3% 蔗糖

＋0.8%琼脂。栽培种胚性愈伤组织或体胚的诱导培养基为 MSB5+15mg/L 2,4 D +

4mg/L AgNO3+600mg/L CH +3% 蔗糖＋0.8%琼脂，体胚萌发及植株再生培养基为

MSB5＋4 mg/L BAP＋4mg/L AgNO3+600mg/L CH +3% 蔗糖＋0.8%琼脂。

3.建立了悬浮细胞系，花生区组野生种 A . chacoensis 胚性愈伤组织在添加

15mg/L 2,4 D 、4mg/L AgNO3、600mg/L CH、0.5%PVP 和 3%蔗糖的 MSB5 液体培

养基中能很好的增殖，在液体培养基中继代培养 5－6 代后可形成稳定的胚性悬浮细

胞系（继代周期为 7 天）。

4. 对花生原生质体分离与培养条件进行研究。材料在含有 Cellulase ONOZUKA

RS ( 纤维素酶，2.0% ) 和 Pectolyase Y-23 (果胶酶，0.1%) 的酶液中，酶解处理 6－7

小时，酶解液中可观察到大量游离原生质体，经纯化处理后培养在添加 1mg/L NAA

和 6mg/L BAP 的固液双层培养基中， 3 天后可观察到细胞分裂，以后细胞继续分

裂。已得到 8823、鲁花 14 和白沙果等原生质体分裂形成的愈伤组织。

5. 对花生与其近缘野生种间细胞融合及培养方法进行研究。将栽培种 8823 体胚与

匍匐区组近缘野生种 A .rignoii 嫩茎分离的原生质体，用 PEG 法融合后，在添加

1mg/L NAA、6mg/L BAP、4mg/L AgNO3、600mg/L CH 和 3%蔗糖的 MSB5 培养基

上进行双层培养，2-3 天后观察到细胞分裂，后形成细胞团，8 周左右，形成直径达

1－2mm 左右的愈伤组织。

关键词 花生（A. hypogaea L.）；A . chacoensis ；A .rignoii ； 组织培养；原生质

体培养；细胞融合； 植株再生

目录

致谢…ⅰ

摘要…ⅱ

英文摘要…………………ⅲ

论文正文

一、前言…………………1

1 花生生产的意义………1

2 花生育种的研究进展…1

2.1 花生常规育种及其存在的问题……………1

2.2 花生属近缘野生种的优点及其应用前景…2

2.3 花生组织培养研究进展…………………3

2.4 花生原生质体培养及融合的研究进展……6

2.4.1 原生质体分离与培养的研究进展………6

2.4.2 原生质体融合与培养研究进展…………7

3 本研究的目的与内容…8

二 材料与方法…………10

1 花生幼叶不定芽诱导及植株再生…………10

1.1 供试材料…………10

1.2 方法……………10

1.2.1 基本培养基…………10

1.2.2 花生种子的萌发……10

1.2.3 幼叶外植体培养及不定芽诱导…………10

1.2.4 不同浓度添加物对幼叶不定芽诱导的影响…………………10

1.2.5 植株再生 ……12

1.2.6 驯化移栽…………12

2. 花生幼叶体细胞胚胎形成及植株再生…12

2.1 供试材料……………12

2.2 方法………………12

2.2.1 基本培养基………12

2.2.2 不同外植体对体胚诱导的影响………12

2.2.3 2,4-D 和毒锈啶对体胚的诱导的影响12

2.2.4 不同基因型对花生体胚的诱导的影响…………………12

2.2.5 植株再生………12

3 花生胚性愈伤的悬浮培养…………………13

3.1 供试材料………13

3.2 方法…………………13

3.2.1 花生胚性悬浮系的建立……………13

3.2.2 培养基中加入抗褐变剂………………13

4 花生原生质体分离与培养…………………13

4.1 供试材料………13

4.2 方法……………13

4.2.1 分离所需的酶及各种试剂……………13

4.2.2 花生原生质体的分离14

4.2.3 原生质体培养………16

4.2.4 原生质体培养所需的培养基…………16

5 花生原生质体融合与培养…………………16

5.1 供试材料………16

5.2 方法16

5.2.1 原生质体分离与融合融合………………18

5.2.2 融合处理后原生质体的培养…………18

三 结果与分析…………19

1 花生幼叶不定芽分化及植株再生……………19

1.1 培养基对花生种子萌发的影响……………19

1.2 NAA 和 BAP 对幼叶不定芽诱导的影响…19

1.3 不同浓度 AgNO3 对花生幼叶不定芽分化的影响……………20

1.4 CH ( 水解蛋白 ) 对花生幼叶不定芽诱导的影响……………20

1.5 不同基因型对花生幼叶不定芽发生的影响21

1.6 植株再生……………21

1.7 驯化移栽………23

2 花生幼叶体细胞胚胎诱导及植株再生………27

2.1 花生不同外植体对体胚诱导的影响……27

2.2 2,4-D 或毒锈啶对体胚诱导的影响………28

2.3 不同基因型花生对体胚的诱导的影响…28

2.4 植株再生……………31

3 花生胚性愈伤的悬浮培养…………………32

3.1 胚性愈伤悬浮系的培养………………32

3.2 抗褐变剂对悬浮培养的影响………………32

3.3 2,4-D 浓度对悬浮培养的影响…………32

4 花生及其近缘野生种原生质体的分离与培养32

4.1 花生原生质体的分离32

4.2 原生质体培养及愈伤组织的形成………37

4.2.1 不同培养基对原生质体培养的影响37

4.2.2 培养方法对原生质体分裂及愈伤组织形成的影响………41

4.2.3 PVP 对原生质体培养的影响…………41

5 花生原生质体的融合与培养………………41

5.1 原生质体的分离与融合………………41

5.2 融合处理后原生质体的培养……………41

四 讨论47

1 影响花生组织培养高频率植株再生因素的研究…………………47

1.1 外植体对不定芽发生的影响………………47

1. 2 基因型对不定芽和体胚发生的影响…47

1. 3 激素配比对不定芽和体胚发生的影响…47

1.4 不同添加物对不定芽发生的影响………48

1.5 花生胚性愈伤的悬浮培48

2 影响花生原生质体分离与培养的因子………49

3 花生原生质体的融合与培养…………………50

五 结论…………………53

参考文献………………55

附录…61

A.缩略语…………………61

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