[硕士论文] 新城疫病毒强毒株单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法研究 [复制链接]

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硕士论文-新城疫病毒强毒株单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法研究，共73页，43993字

中 文 摘 要

新城疫(Newcastle Disease，ND)也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒引起的

一种禽类急性、高死亡率、高度接触性传染病。因此建立快速、准确的强致病性 NDV

抗原的检测方法[2]，对新城疫的早期诊断和疫病净化具有深远的意义。

本研究应用 NDV 标准强毒株 F48E9，通过研制针对强毒的特异性单克隆抗体，并

将之作为诊断试剂，建立 NDV 抗原夹心 ELISA 检测方法。

首先，以凝胶过滤或连续蔗糖密度梯度方法提纯 NDV，然后免疫 BalB/C 小鼠，

通过细胞融合与克隆筛选出 8 株稳定分泌针对 NDV 的杂交瘤细胞株 4C1、4E1、3A2、

3B4、6C4、8D4、5E5 和 4B6，用间接 ELISA 方法测得 8 株腹水单抗的效价介于

1∶4.8×103～1∶3.6×105 之间。间接 ELISA 和 Western-blot 试验结果表明，8 株单抗

中，5E5 株是只针对强致病性 NDV 特异性抗原表位的单抗，其余株均与强弱 NDV

抗原表位有交叉反应。

将 5E5 株单抗腹水纯化后建立了用于检测强毒的双抗体夹心 ELISA 方法，并对

各参数进行优化，筛选出最佳反应体系，通过对已知 NDV 阳性抗原、阴性抗原和临

床待检组织样品的鉴别检测，同时用病毒分离和 RT-PCR 方法平行检测做对照。

结果显示，在临床感染鸡的肺脏样品可以检测到抗原，而且对相同样品的检测与

病毒分离、RT-PCR 两种方法的检测结果一致；且用夹心 ELISA 方法对相同个体不同

组织中 NDV 抗原的检测，肺脏的阳性检出率最高，初步确定肺脏为检测首选组织。

上述结果表明，该方法敏感、特异、省时、便捷，能够同时检测大批量样品，而

且具有半自动化的优点，是一种理想的 NDV 抗原检测方法。

关键词：NDV；强毒；单克隆抗体；夹心 ELISA；

目录

前 言·1

中文摘要··········3

英文摘要··········4

第一部分 绪 论·········6

第一章 新城疫病毒分子生物学及诊断方法研究进展··········6

第二章 单克隆抗体技术的新近展·17

第二部分 研究内容····23

第一章 新城疫病毒的培养和纯化·23

1 材 料········23

2 方 法········25

3 结 果········27

4 讨 论········29

5 小 结········30

第二章 鼠抗 NDV 单克隆抗体的制备···········31

1 材 料········31

2 方 法········32

3 结 果········37

4 讨 论········43

5 小 结········45

第三章 夹心 ELISA 检测 NDV 抗原方法的建立·······46

1 材 料········46

2 方 法········47

3 结 果········50

4 讨 论········55

5 小 结········58

结 论59

参考文献·········60

附 录65

致 谢66

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