[硕士论文] 山东主栽果树AFLP指纹图谱的构建 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-山东主栽果树AFLP指纹图谱的构建，共57页，27542字

摘要

本研究选用苹果（Malus pumila Mill.）、梨（Pyrus. L）、桃（P. persica Batch）和

枣（Ziziphus jujube Mill.）4 种山东主栽果树共 53 个品种作为试材，应用 ALFP

（Amplified Fragment Length Polymorphism, 扩增片段长度多态性）技术构建了这 4

个树种的 DNA 指纹图谱，并应用其 DNA 指纹图谱对试材进行了分子水平鉴定和遗

传关系分析。

采取新鲜叶片作为果树基因组 DNA 的提取材料，采用改良 CTAB 法提取果树基

因 组

DNA 。 其 提 取 液 成 分 为 ： 3%CTAB,1.4mol/L

NaCl ，

20mmol/LEDTA,100mmol/LTris.HCl（pH8.0）,2%β-巯基乙醇。粗提后 DNA 经酚/氯仿/

异戊醇抽提两次，除去蛋白质，经 RNase 除去 RNA，最后用氯仿/异戊醇除去多余的

RNase，得到了浓度大，基本无降解，蛋白质和 RNA 去除彻底，纯度高、质量好的果

树基因组 DNA。

通过对内切酶用量、酶切时间、连接时间、稀释倍数等的研究，建立了适于果树

分析的 AFLP 银染技术体系。在 50μL 酶切连接体系中，含基因组 DNA 200-500 ng，

NEB Buffer2 5μL，BSA 0.25μL，EcoRI（20U/μL） 0.25μL，MseⅠ（10U/μL） 0.5μL，

EcoRⅠ接头（adapter）(5pMol/μL)1.0μL，MseⅠ接头（adapter）(50pMol/μL) 1.0μL，

加无菌水 ddH2O 至 50μL ，37℃过夜；酶切连接产物进行预扩增，预扩产物稀释 20

倍进行选择性扩增，加入 7μL 上样缓冲液（Loading buffer），95℃变性 5 min，立即

冰浴；在 6.0%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，银染法检测 PCR 产物。

从 40 对引物组合中筛选出 8 对引物组合对 53 个供试品种进行了扩增，初步构建

了苹果、梨、桃和枣 4 种果树的 AFLP 指纹图谱。通过分析指纹图谱中品种的特异带，

可以将烟富系的 6 个品系分成 2 组：烟富 1 号和 2 号为一组，烟富 3 号至 6 号为一组；

可以将供试的 21 个梨品种和 7 个枣品种全部区分开。这体现出了 AFLP 在品种鉴定

上的高效率，如继续筛选引物组合，可以区分开供试所有品种。

根据构建的 DNA 指纹图谱，采用 NTSYS 软件计算简单匹配系数（Sm），进行

分析，建立了苹果和桃 2 种果树品种的聚类分析树状图，分析了这 2 个树种的遗传多

样性，初步揭示了树种内品种间的亲缘关系，为品种鉴定、种质资源保存及育种亲本

选配，提供了理论依据。

关键词： 果树；AFLP；DNA 指纹图谱；聚类分析；品种鉴定

中文摘要…..i

英文摘要…..ii

论文正文

第 一章 文 献综 述 …… … .. …… …… …… … …… … ..1

国内外研究动态….….…….1

DNA 指纹图谱技术研究进展……….…………...…….….1

RFLP..….…........1

RAPD……......2

SSR…………..2

AFLP………...3

DNA 指纹图谱技术在果树研究上的应用….4

苹果……….…5

梨……….……5

桃………….…6

其它果树….…6

第二章

研究的目的意义…………...7

苹果、梨、桃和枣指纹图谱的构建.…..9

试验材料.…….……...……….…….……9

试验方法…..………...….....9

模板基因组 DNA 的制备………..……….…...9

DNA 提取试剂的配制……..……….…...9

DNA 提取的步骤………....10

DNA 样品纯度和浓度的检测方法…....11

AFLP-PCR 技术体系的建立.….....12

酶切与连接……….…….....12

预扩增………….……….....14

预扩增产物的检测方法……….……….14

选择性扩增………….….....14

高压电泳…….…......15

电泳试剂的配制……...…..15

电泳步骤….….15

银染…...16

2.3.4.1

2.3.4.2

银染试剂的配制………….16

银染步骤…….16

结果与分析...17

模板 DNA 样品纯度与浓度的检测….17

AFLP 技术体系的研究…19

酶切连接体系的建立……….19

预扩增产物的检测………….20

预扩增产物稀释倍数的确定.20

选择性扩增引物的设计…….27

选择性扩增产物的检测…….28

果树品种的 AFLP 指纹图谱………..28

苹果品种的 AFLP 指纹图谱…28

梨品种的 AFLP 指纹图谱……28

桃品种的 AFLP 指纹图谱……28

枣品种的 AFLP 指纹图谱……29

2.4 讨论…………..29

果树基因组 DNA 的提取…………..29

AFLP 分析中的影响因素30

果树的品种鉴定……….31

第三章 苹果和桃的聚类分析………37

试验材料………..……….37

试验方法…………..…….37

结果与分析….37

苹果品种的聚类分析…………..37

桃品种的聚类分析..39

讨论………….40

3.4.1 亲缘关系分析……….40

遗传多样性分析……….………….40

结论………..42

参考文献…..43

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• 硕士论文-山东主栽果树AFLP指纹图谱的构建
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