[硕士论文] 鹅细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆及原核表达 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-鹅细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆及原核表达，共60页，23450字

摘要

鹅细小病毒（Goose Parvovirus，GPV）是小鹅瘟的直接病原。临床病理变化以消化道，尤

其是小肠部位典型纤维性栓塞为特征。我国学者方定一于 1961 年首次分离到 GPV 的病原体。

GPV 是细小病毒科、细小病毒属成员，属自主复制型细小病毒。病毒基因组为单股、线性 DNA，

核苷酸序列长约 5.1kb，含有两个开放阅读框架（ORF），右侧 ORF（RORF）编码 3 种结构蛋白（VP），

即 VP1、VP2、VP3；左侧 ORF（LORF）编码非结构蛋白 NS1 和 NS2，参与调节病毒生命周期的各个

环节。

检索 GenBank 所发表的 GPV B 株全基因序列，借助 Primer Premier 5.0 和 Oligo 6.44 软件

设计一对引物，采用 PCR 技术扩增 GPV YZ 株非结构蛋白 NS1 基因，并与 PMD18-T 载体连接后测

序。利用软件 dnassist 2.2 对测序结果进行分析，结果表明：GPV YZ 株非结构蛋白 NS1 基因核

苷酸全长 1881bp，编码 627 个氨基酸残基。与 GPV B 株的 NS1 基因相比，核苷酸数目相同，有

36 个碱基、13 个氨基酸的差异。二者核苷酸序列同源性为 98.09％，推导氨基酸序列同源性为

97.93％。

将 NS1 基因插入到原核表达质粒 PQE-30Xa 的 BamH I、Sal I 多克隆位点之间，将重组原核

表达质粒 PQE-30Xa-NS1 转化到大肠杆菌 M15 感受态细胞中，获得表达 NS1 基因的阳性重组子，

在含 Amp 的 LB 液体培养基中培养，经 IPTG 诱导表达，用 SDS-PAGE 分析表达产物。结果表明：

NS1 基因在原核表达细菌大肠杆菌 M15 中获得了高效表达，表达产物为约 73ku 的融合蛋白，表达

量达菌体总蛋白的 26.5％。

应用蛋白质分析软件 ANTHEPROT 5.0 对得到的 GPV YZ 株的 NS1 蛋白进行蛋白序列的理化特

性、蛋白质的二级结构、蛋白滴定曲线与等电点、蛋白序列分子量、比重与各蛋白残基百分组成、

蛋白质信号肽潜在的断裂位点等进行分析，得出了相应的特征曲线和分析结果，为进一步研究其

生物和免疫学性质奠定了基础。

关键词：鹅细小病毒、NS1 基因、克隆、序列分析、原核表达

目录

摘要

Abstract

第一部分 文献综述

1 小鹅瘟的研究简史

2 小鹅瘟的病症学概况

3 鹅细小病毒的类型

4 鹅细小病毒的生物学特性

4.1 GPV 的分类及形态学特征

4.2 GPV 的理化特征

4.3 GPV 的培养特性

5 鹅细小病毒的基因组结构特点

6 鹅细小病毒的结构蛋白与非结构蛋白

6.1 结构蛋白

6.2 非结构蛋白

7 鹅细小病毒与其它细小病毒的关系

7.1 鹅细小病毒与番鸭细小病毒的关系

7.2 鹅细小病毒与依赖病毒属成员的关系

7.3 鹅细小病毒与红病毒属成员的关系

8 本试验的目的和意义

第二部分 材料与方法

1 材料与仪器

种毒

质粒与菌种

引物

主要试剂

主要仪器设备

2 实验方法

2.1 ＧＰＶ病毒的增殖及鉴定

2.2 ＧＰＶ病毒核酸的提取（蛋白酶Ｋ、SDS 法）

2.3 ＧＰＶ的ＮＳ１基因的ＰＣＲ扩增

2.4 ＧＰＶ的ＮＳ１基因扩增产物的纯化

2.5 目的 DNA 片段克隆至 PMD18-T 载体并测序

2.5.1 制备 JM109 感受态细胞

2.5.2 NS1 基因与 PMD18-T 载体连接和转化

2.5.3 碱裂解法小剂量制备质粒

2.5.4 阳性重组质粒 PMD18-T-NS1 的鉴定

2.5.4.1 阳性重组质粒 PMD18-T-NS1 的酶切鉴定

2.5.4.2 阳性重组质粒 PMD18-T-NS1 的 PCR 鉴定

GPV 株 NS1 基因的序列鉴定

GPV 株 NS1 基因的序列分析

目的 DNA 片段克隆至 PQE-30Xa 载体并在大肠杆菌 M15 中表达

阳性重组质粒 PMD18-T-NS1 的双酶切

带粘性末端的 NS1 基因片段的纯化

PQE-30Xa 的双酶切

PQE-30Xa 的双酶切产物的纯化

NS1 基因与 PQE-30Xa 的连接和转化

阳性重组质粒 PQE-30Xa-NS1 的鉴定

阳性重组质粒 PQE-30Xa-NS1 的酶切鉴定

阳性重组质粒 PQE-30Xa-NS1 的 PCR 鉴定

阳性重组质粒 PQE-30Xa-NS1 转化入大肠杆菌 M15

阳性菌株的酶切鉴定

阳性重组子的诱导表达

表达产物的 SDS－PAGE 电泳和薄层扫描分析

SDS 聚丙烯酰胺凝胶的配制

SDS 聚丙烯酰胺凝胶的灌制

SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶的染色、脱色和干燥

第三部分 结果与讨论

1 结果

病毒的增殖和鉴定

GPV YZ 株 NS1 基因的克隆及序列分析

GPV YZ 株 NS1 基因的扩增

重组质粒 PMD18-T-NS1 的酶切鉴定

NS1 基因的测序结果及序列分析

GPV YZ 株 NS1 基因原核表达载体的构建

重组质粒 PQE-30Xa-NS1 的酶切鉴定

大肠杆菌 M15 阳性菌株的筛选与酶切鉴定

NS1 基因的表达及 SDS-PAGE 分析

表达产物的 SDS-PAGE 分析

表达产物的薄层扫描定量分析

NS1 基因表达蛋白的软件分析

蛋白序列的理化特性曲线

1.5.2 蛋白质的二级结构预测

Gibrat 方法

Levin 方法

Garnier 方法

DPM 方法

1.5.2.5 几种方法综合使用

2 讨论

蛋白序列滴定曲线与等电点

蛋白序列分子量，比重与各蛋白残基百分组成

蛋白质信号肽潜在的断裂位点预测

GPV YZ 株非结构蛋白 NS1 基因的克隆及序列分析

重组原核表达载体的构建

NS1 基因的原核表达及 SDS-PAGE 分析

PQE-30Xa 表达系统

蛋白质分析软件 ANTHEPROT 5.0 的使用

3.结论

参考文献

附录

1 pQE-30 Xa 载体模式图

2 英文缩写词表

致谢

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