[硕士论文] 猪血Cu/Zn-SOD的分离纯化及其理化性质的研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-猪血Cu/Zn-SOD的分离纯化及其理化性质的研究，共60页，36567字

摘 要

以新鲜猪血为材料，在低温条件下，离心除去血浆后，用生理盐水洗涤红细胞。向

干净的红细胞中加入等体积的超纯水搅拌得溶血液。将溶血液依次进行乙醇-氯仿处理

除去血红蛋白、热变性、超滤浓缩和丙酮沉淀，得到了SOD粗酶液，再经过DE-FF柱层

析、超滤浓缩及冷冻干燥得纯化SOD。本实验对热变性的温度（40℃、45℃、50℃、55℃、

60℃、65℃、70℃、75℃）与时间（10min、15min、20min、25min、30min）、丙酮沉淀

时丙酮与粗酶液体积比（0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0）及DE-FF柱层析的洗脱速

度（1.0ml/min、1.5 ml/min、2.0 ml/min）与进样量（0.5ml、1.5ml、2.5ml）的最佳工艺

参数进行确定，最后确定热变性的最适温度与时间分别为55℃和20min，丙酮与粗酶液

的最适体积比为1.2，DE-FF柱层析的最适洗脱速度与进样量分别为1.5ml/min和1.5ml。

经过上述纯化路线最终获得SOD回收率为58%，比活力7357.224U/mg，经聚丙烯酰胺凝

胶电泳分析，纯化的猪血Cu/Zn-SOD达到电泳纯。

对纯化的猪血Cu/Zn-SOD的理化性质进行分析，结果表明：猪血Cu/Zn-SOD亚基分

子量为16.069kDa，分子量为32.138kDa。同时发现超氧化物歧化酶是一种对热和酸碱度

稳定性较好的酶。温度在低于60℃时，猪血Cu/Zn-SOD活性相对稳定。在pH5.0～9.0条

件下，酶的活力相对稳定，并且在pH7.0～8.0时酶活性为最高，但在pH<5.0和pH>9.0的

情况下，此酶很容易失活，在pH=12.0时酶完全丧失活性。

关键词：猪血；超氧化物歧化酶；分离纯化；理化性质

目录

中文摘要 ……………….1

英文摘要 ……………….2

英文缩写词与名词注释 .3

1 前言 .4

1.1 SOD 的种类与分布 ...4

1.2 SOD 的分子结构 …...5

1.3 SOD 与自由基 ...8

1.4 Cu/Zn-SOD 的作用机理 ...9

1.5 Cu/Zn-SOD 的性质及其研究概况 …...10

1.6 动物血 Cu/Zn-SOD 的纯化方法 …13

1.7 SOD 的应用 ….15

1.8 研究的目的和意义 .18

2 . 材料和方法 …. . 1 9

2.1 实验材料 .19

2.1.1 新鲜猪血 …..19

2.1.2 主要试剂 …..19

2.1.3 主要仪器 …..19

2.2 超氧化物歧化酶的活力测定 .20

2.3 蛋白质浓度的测定 .21

2.4 猪血中 Cu,Zn-SOD 的分离纯化 …22

2.4.1 血液预处理 ..22

2.4.2 去除血红蛋白 …..22

2.4.3 热变性去除杂蛋白 …..22

2.4.4 丙酮沉淀 …..23

2.4.5 超滤浓缩 …..23

2.4.6 DEAE-Sepharose Fast Flow 层析….23

2.4.7 猪血 Cu/Zn-SOD 最终提取流程 … … … … …….23

2.5 猪血 Cu/Zn-SOD 的纯度鉴定 24

2.6 猪血 Cu/Zn-SOD 亚基分子量测定 … …25

2.7 SOD 的稳定性 .26

2.7.1 SOD 对 pH 的稳定性………………27

2.7.2 SOD 对温度的稳定性 .27

2.8 数据统计分析方法 27

3 结果 ………………...28

3.1 血液预处理 …..28

3.2 去除血红蛋白 ..28

3.3 热变性去除杂蛋白 ..28

3.3.1 热变性温度对 SOD 粗酶液的影响 …28

3.3.2 热变性时间对 SOD 粗酶液的影响 ….30

3.4 丙酮沉淀 .32

3.4.1 丙酮处理对 SOD 粗酶液活力的影响 32

3.4.2 丙酮处理对 SOD 粗酶液蛋白质含量的影响 …33

3.4.3 丙酮处理对 SOD 粗酶液比活力的影响 …33

3.5 超滤浓缩 .34

3.6 DE-FF 层析 …..34

3.6.1 流速对柱层析的影响 ..35

3.6.2 进样量对柱层析的影响 …..35

3.7 猪血 Cu/Zn-SOD 最终提取流程 …36

3.8 猪血 Cu/Zn-SOD 的纯度鉴定 36

3.9 猪血 Cu/Zn-SOD 亚基分子量测定 … …37

3.10 SOD 的稳定性 …...38

3.10.1 pH 对 SOD 活性的影响………….38

3.10.2 温度对 SOD 活性的影响 ..38

4 讨论 ………………...40

4.1 温度对纯化 SOD 影响 …40

4.2 超滤浓缩对纯化 SOD 影响 …40

4.3 DE-FF 层析 …..40

4.4 猪血 Cu/Zn-SOD PAGE 电泳……….42

5 结论 ………………...43

参考文献 ……………...44

致

谢 ……………49

攻读硕士期间发表的论文 ……………50

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