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硕士论文-牛羊大肠杆菌K99-STⅠ双价保护性抗原基因工程菌株的构建及免疫原性研究，共72页，36224字

摘 要

1.采用 PCR 技术，扩增出 0.54kb 的 K99(F5)菌毛抗原基因，将其克隆到 pUCm-T 载体上，

酶切鉴定成功构建重组质粒 pUCm-K99；人工合成的耐热肠毒素 STⅠ基因片段和重组质

粒 pUCm-K99，经酶切(BamHⅠ＋SalⅠ)、回收、连接，将 STⅠ基因片段插入 K99 菌毛抗

原基因的下游，经酶切和 PCR 方法鉴定，获得阳性重组质粒 pUCm-K99-ST，经过测序分

析证明完成 K99-ST 融合基因的构建。

2.重组质粒 pUCm-K99-ST 经 EcoRⅠ+SalⅠ消化，获得 K99-ST 基因片段。将该片段分别

插入表达载体 pGEX-4T-1 及 pET-30a 中，筛选阳性重组质粒分别命名为 pGEX-K99-ST 和

pET-K99-ST。将重组质粒 pGEX-K99-ST 和 pET-K99-ST 分别转入大肠杆菌 BL21（DE3）中，

摸索最佳诱导条件（37℃,IPTG0.4mM/l,220r/min 诱导 4h），SDS 电泳分析，pGEX-K99-ST

表达量相对较低，约为 10%左右；而 pET-K99-ST 表达量较高约为 25%以上；融合蛋白经

回收、复性处理后，琼扩实验结果表明，K99-ST 融合基因在工程菌 BL21 中获得表达，

并具有与 K99 抗体结合的活性。

3.通过反向间接血凝技术，检测融合蛋白复性后的抗原滴度可以达到 1：40。纯化融合

蛋白后，使用弗氏佐剂对其进行包裹并免疫家兔（1d，14d，21d），免疫剂量（抗原滴

度是 1：40）为 0.5mL/只，Western-blot 证实融合蛋白具有良好的免疫原性。根据专利

ZL89106871.6 配制相应疫苗（包涵体粗提物蜂胶疫苗、工程菌全菌体蜂胶苗、工程菌全

菌体灭活苗），使用小白鼠进行安全性试验和动物攻击试验，试验证实安全性良好，保

护率较高。上述三种疫苗免疫家兔后采集抗血清，与处理后的强毒株上清温育，对 1-3

日龄的乳鼠进行毒素中和试验，试验证实抗血清足以中和强毒株的 STⅠ肠毒素。

关键词：大肠杆菌；融合基因；融合蛋白；Western-blot；中和试验；攻击试验

目录

摘 要...... 1

ABSTRACT.... 2

英文缩写词表. 3

前 言...... 4

第一部分 文献综述 5

综述前言. 5

毒力因子. 5

2. 1 黏附素...... 5

2. 2 肠毒素...... 9

毒力岛....11

产肠毒素性大肠埃希氏菌基因工程疫苗的研究进展 11

4.1 大肠埃希氏菌 K88-K99 双价基因工程疫苗...... 12

4. 2 大肠埃希氏菌 K88ac-LTB 双价基因工程疫苗 . 13

4. 3 大肠埃希氏菌 K99-F41 双价基因工程疫苗...... 14

4. 4 大肠埃希氏菌 ST-LT 双价基因工程疫苗. 14

第二部分 大肠杆菌菌毛抗原 K99 与耐热肠毒素 STⅠ融合基因的克隆与核苷酸序列测定...... 17

1 材料与方法 ........ 17

1.1 材料........ 17

1.2 方法........ 18

2 结果 .. 23

2.1 目的基因 K99 序列的扩增........ 23

2.2 K99 目的基因与 pUCm-T 载体连接.. 23

2.3 融合基因的构建....... 23

2.4 K99 目的基因及 K99-STⅠ融合基因测序 . 23

3 小结与讨论 ........ 23

3.1 小结 23

3.2 引物的设计...... 26

3.3 选择合适的内切酶用来鉴定..... 26

3.4 融合基因的构建....... 27

第三部分 融合基因 K99-STⅠ原核表达系统的的构建和融合蛋白的表达 ....... 28

1 材料与方法 ........ 28

1.1 材料 28

1.2 方法........ 30

2 结果 .. 37

2.1 pGEX-K99-ST 和 pET-K99-ST 原核表达载体的构建 37

2.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析 ... 38

2.3 表达产物的琼扩试验....... 40

3 讨论 .. 40

3.1 重组子的鉴定.. 40

3.2 融合蛋白的表达....... 42

3.3 表达产物的蛋白电泳(SDS-PAGE)..... 42

3.4 包涵体的纯化、复性....... 42

第四部分 重组表达菌株免疫原性的检测....... 44

1 材料与方法 44

1.1 试验动物和器材....... 44

1.2 RIHA 方法检测融合蛋白抗原滴度 ... 44

1.3 表达产物的 Western-blot 分析 .. 45

1.4 重组菌株 STⅠ毒性的测定 ...... 46

1.5 抗原制备. 46

1.6 安全性试验及动物保护性试验. 46

1.7 毒素中和试验.. 46

2．结果 47

2.1 RIHA 方法检测融合蛋白表达量 ....... 47

2.2 表达产物的 Western-blot 分析 .. 47

2.3 重组菌株毒性的测定........ 47

2.4 安全性及免疫保护试验.... 48

2.5 STⅠ肠毒素中和试验 ....... 49

3．讨论 49

3.1 反向间接血凝.. 49

3.2 表达产物的免疫印迹(Western-blot)... 50

3.3 免疫攻毒保护试验.. 50

第五部分 结论...... 51

参考文献....... 52

致谢...... 57

攻读硕士期间发表的论文：.. 58

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