[硕士论文] 五龙鹅IGF－IcDNA及5非翻译区的克隆与表达研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-五龙鹅IGF－IcDNA及5非翻译区的克隆与表达研究，共81页，40089字

摘要

胰岛素样生长因子-Ⅰ（Insulin-like Growth Factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）是胰岛素样生长因

子的重要成员，对机体的生长发育、组织修复、营养代谢、细胞凋亡以及细胞分化等方

面有重要的生物学作用。本试验以五龙鹅为研究对象，克隆了 IGF-Ⅰ基因 cDNA 和 5’

非翻译区部分序列，分析了序列的结构、同源性及蛋白的空间结构，对 IGF-Ⅰ进行了原

核表达，并检测了 IGF-Ⅰ基因在五龙鹅 10 种组织中的表达情况。将为进一步研究 IGF-Ⅰ

基因的结构与功能、 IGF-Ⅰ基因对五龙鹅生长发育的调控以及其与生产性能、经济性

状之间的关系提供理论依据。结果如下：

1

根据鸡（M32791）、鸭（AB061721）等的 IGF-Ⅰ基因保守序列设计引物，运用

RT-PCR 法从五龙鹅肝脏总 RNA 中克隆了 562bp 的 IGF-Ⅰ基因 cDNA 部分序列

（GenBank 登录号为 DQ662932），其中包括 462bp 的完整编码区。五龙鹅 IGF-Ⅰ基因

编码 153 个氨基酸，成熟肽分子量为 7743.8 Daltons，等电点 pI 为 7.78；在第 36～39

个氨基酸处存在一个较强的疏水区；在第 37～116 个氨基酸处存在一个蛋白质超家族；

56.5 %的 IGF-Ⅰ蛋白可能存在于细胞核；蛋白的空间结构主要有 3 个 α 螺旋组成。序列

与鸭、鸡、火鸡、鸵鸟、鹌鹑的氨基酸同源性分别为 100.0％、99.3％、98％、99.3％、

98.7％，进化关系与鸭最近。

2

根据鸡的序列（M74176），并参照 Kansaku 发表的鸭的 5’非翻译区序列设计兼

并引物，从五龙鹅基因组 DNA 中克隆了 796bp 的 5’非翻译区部分序列（GenBank 登录

号为 DQ988932）。获得的序列与鸭相比有 4 处碱基缺失和 7 处碱基插入，同源性为 98.1

％；与鸡相比有 4 处碱基缺失和 3 处碱基插入，同源性为 93.0％；共有 5 种常见的限制

性内切酶的酶切位点 9 处。

3

根据已测得的五龙鹅 IGF-Ⅰ基因的序列（DQ662932）设计引物，克隆了表达

IGF-Ⅰ基因成熟蛋白部分的 IGF-Ⅰm 序列 228bp。将此片段插入到 pET-32a 质粒中，构

建重组质粒 pET-IGF-Ⅰm，经 PCR 和酶切鉴定为阳性后，转化 E. coli. BL21，经

1.0mM IPTG 25℃诱导 4h，目的基因的表达量较高。SDS-PAGE 电泳显示表达产物分子

量约为 28KD， Western 印迹试验进一步表明，表达的蛋白为目的蛋白。

4

根据已测得的五龙鹅 IGF-Ⅰ基因的保守区序列设计引物，提取五龙鹅心、脾、

肝、肺、肾、胸肌、腿肌、睾丸、脂肪、脑 10 种组织的总 RNA，建立了利用 Real-time PCR

技术检测组织中 IGF-Ⅰ基因表达量的方法。最佳反应条件为：SYBR Green Ⅰ终浓度为

1×，退火温度为 59℃，此时，熔解曲线显示单峰且峰值单一。五龙鹅 IGF-Ⅰ基因在各

组织中的表达量的关系为：肝>脑>脾>腿肌>胸肌>肺>心>睾丸>脂肪>肾。

关键词：五龙鹅；胰岛素样生长因子-Ⅰ； 基因克隆； 原核表达； 组织表达

目录

中文摘要………………1

英文摘要………………3

英文缩写词表…………5

前言6

文献综述………………7

第一章 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因 cDNA 序列的克隆与分析………17

1.1 试验材料与方法…17

1.1.1 试验材料………17

1.1.2 试验方法………19

1.2 结果与分析………24

1.2.1 五龙鹅肝脏总 RNA 的提取…………24

1.2.2 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因 cDNA 的扩增…25

1.2.3 扩增条件的优化25

1.2.4 目的片段的转化25

1.2.5 质粒 DNA 的 PCR 扩增检测 ………26

1.2.6 重组质粒的序列测定………………26

1.2.7 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因的生物信息学分析…………………26

1.3 讨论……………32

1.4 小结……………33

第二章 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因 5’非翻译区部分序列的克隆与分析…………………34

2.1 试验材料与方法…34

2.1.1 试验材料………34

2.1.2 试验方法………34

2.2 结果与分析………35

2.2.1 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因 5’非翻译区部分序列的 PCR 扩增与鉴定………………35

2.2.2 重组质粒的 PCR 鉴定………………35

2.2.3 重组质粒测序结果…………………35

2.2.4 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因 5’非翻译区部分序列测序结果分析…………………36

2.3 讨论………………38

2.4 小结………………39

第三章 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因的原核表达…40

3.1 试验材料与方法 40

3.1.1 试验材料………40

3.1.2 试验方法………41

3.2 结果与分析………45

3.2.1 RT-PCR 扩增产物的电泳结果………45

3.2.2 重组质粒 pET-IGF-Ⅰm 的鉴定……46

3.2.3 pET-IGF-Ⅰm 的诱导表达及表达条件的优化 …………47

3.2.4 表达产物的 Western 印迹分析 49

3.3 讨论………………49

3.4 小结………………50

第四章 组织中 IGF-Ⅰ基因的表达量检测 …………………51

4.1 试验材料与方法…51

4.1.1 试验材料………51

4.1.2 试验方法………51

4.2 结果与分析………53

4.2.1 组织中 RNA 提取结果………………53

4.2.2 标准曲线的制作53

4.2.3 IGF-Ⅰ基因在组织中的表达量检测54

4.3 讨论………………56

4.4 小结………………57

全文结论……………58

参考文献………………59

附录64

致谢68

攻读硕士期间发表的论文…………………69

资料文件预览：
共1文件夹，1个文件，文件总大小：3.45MB，压缩后大小：2.10MB

• 硕士论文-五龙鹅IGF－IcDNA及5非翻译区的克隆与表达研究
• 硕士论文-五龙鹅IGF－IcDNA及5非翻译区的克隆与表达研究.doc  [3.45MB]