[硕士论文] 蛋白质磷酸化对小鼠卵母细胞体外成熟的调控 [复制链接]

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硕士论文-蛋白质磷酸化对小鼠卵母细胞体外成熟的调控，共54页，33030字

摘要

卵母细胞的成熟过程受细胞内蛋白质磷酸化的调控，而蛋白质磷酸化受蛋白

激酶（Protein kinase，PK）和蛋白磷酸酶（Protein phosphatase，PP）的双重调控。

有关蛋白激酶活性的调控对小鼠卵母细胞成熟的影响研究已有许多报道，但是蛋

白磷酸酶活性及其调控对小鼠卵母细胞成熟的研究尚未多见。本研究的目的旨在

证明小鼠卵母细胞中蛋白磷酸酶的存在及其活性的调控对卵母细胞成熟的影响。

本试验以 6-12 周龄昆明小鼠为实验材料，进行了以下研究。

1. 各种类型卵母细胞的体外成熟及体外受精

从卵巢中获取卵母细胞，将其分成 3 类，即卵丘 - 卵母细胞复合体

（Cumulus-oocyte complexs，COCs）、部分裸露卵（partly naked oocyte，PNO）、裸卵

(naked oocyte，NO），分别在体外培养12h并进行体外受精。结果显示，NO的成熟

率（%）显著（P <0.05）低于PNO（%）和COCs（%）的成熟率，而PNO和COCs

之间无显著差异；同样，NO的受精率（%）显著（P <0.01）低于PNO（%）和

COCs（%）的受精率，而PNO和COCs之间无显著差异。这些结果表明，卵丘细

胞有利于卵母细胞的成熟及受精。

2. 小鼠卵母细胞中蛋白磷酸酶活性

将体外培养的不同时期的卵母细胞，用PNPP蛋白磷酸酶试剂盒进行蛋白磷

酸酶测定。结果显示，生发泡期（germinal vesicle，GV）蛋白磷酸酶活性为0.09，

生发泡破裂期（germinal vesicle breakdown，GVBD）酶活性显著（P <0.01)下降

（0.065），而第一次减数分裂中期（metaphase I，MI）又显著（P <0.01）升高（0.138），

到第二次减数分裂中期（metaphase II，MII）又显著下降（0.07）。这些结果表明，

小鼠卵母细胞中含有蛋白磷酸酶，其活性随不同发育时期改变。

3. 小鼠卵母细胞中 PP1、PP2A 的确定

经特异抑制剂花萼海绵诱癌素A（calyculin A，CL-A）和冈田酸（okadaic acid，

OA）抑制试验证明，卵母细胞蛋白磷酸酶中存在PP1和PP2A。其中MI期PP2A活

性（0.008）显著高于GV和GVBD期（0.0080，0.0046），差异极显著（P <0.01)，

与MII期相比，差异显著（P <0.05）。PP1 GVBD期的活性（0.002）明显低于GV

期（0.0032）差异显著（P <0.05），其它各期差异不显著（P >0.05）。这些结果表

明，小鼠卵母细胞中含有PP1、PP2A和其它蛋白磷酸酶，且PP1、PP2A参与小鼠

卵母细胞成熟过程的调控。

4. PP1/PP2A 对小鼠卵母细胞体外成熟和受精过程的调控

用 50nMCL-A 或 1.0μM OA 对卵母细胞进行不同时间处理，观察对卵母细胞

成熟和受精的影响。结果显示，用 CL-A 和 OA 长时间（24h）处理 GV 完整的

小鼠卵母细胞，可提高 GVBD 发生率，但不能正常发育到 MII 期，且大多数表

现出细胞质异常。经短暂处理 10min，可显著增强 GVBD，能发育到 MII 且不增

加细胞质异常发生率，并可正常受精。这些结果表明，PPl/PP2A 是卵母细胞从

GVBD 向 MⅡ期发育所必需的生理物质，对维持细胞质的正常形态起了非常重

要的作用。

关键词：蛋白磷酸酶；卵母细胞；体外成熟；减数分裂；OA；CL-A

目录

摘 要………………

英文摘要……………

中英文缩略词表……

1．前言………………

2．文献综述…………

2.1 蛋白可逆磷酸化对哺乳动物卵母细胞体外成熟和受精的影响……

2.2. 蛋白激酶的研究进展……………

2.2.1 蛋白激酶的分类………………

2.2.2 蛋白激酶在卵母细胞成熟和受精中的作用……

2.2.3 MPF 调节卵母细胞成熟的机制

2.2.4 MAPK 对卵母细胞成熟的调节

2.3 蛋白磷酸酶在卵母细胞成熟和受精中的作用……

2.3.1 蛋白磷酸酶的研究进展………

2.3.2 蛋白磷酸酶的抑制剂…………

2.4 蛋白磷酸酶在哺乳动物卵母细胞减数分裂和受精中的作用………

2.4.1 蛋白磷酸酶在卵母细胞中的定位………………

2.4.2 蛋白磷酸酶与减数分裂的启动…

2.4.3.蛋白磷酸酶与 MII 期阻滞………

2.4.4.蛋白磷酸酶在受精中的作用…

3．材料与方法………

3.1 试验动物………

3.2 试剂……………

3.3 仪器设备………

3.4 主要液体的配制

3.5 未成熟卵母细胞的收集…………

3.6 未成熟卵母细胞的体外成熟培养

3.7 成熟卵母细胞的体外受精与胚胎培养……………

3.8 小鼠卵巢卵母细胞的磷酸酶检测

3.8.1 卵母细胞的破碎

3.8.2 加入抑制剂 OA，CL-A，卵母细胞中蛋白磷酸酶浓度的测定………

3.9 统计分析………

4．实验设计与结果…

4.1 小鼠卵母细胞的体外成熟及受精

4.2 不同减数分裂期卵母细胞蛋白磷酸酶活性检测…

4.3 GV 期卵母细胞蛋白磷酸酶 1 和 2A 活性检测……

4.4 PP1/PP2A 对小鼠卵母细胞体外成熟和受精过程的调控……………

4.4.1PP1/PP2A 在卵母细胞 GV、GVBD 的调节作用…

4.4.2 PP1/PP2A 在 GVBD 后的减数分裂及受精中的作用………………

5．讨论……………

5.1 小鼠不同类型卵母细胞体外成熟及受精的比较…

5.1.1 COCs、PNO 和 NO 的减数分裂能力………………

5.1.2 COCs、PNO 和 NO 的体外受精能力……………

5.2 小鼠卵母细胞中蛋白磷酸酶的存在………………

5.2.1 减数分裂不同阶段卵母细胞蛋白磷酸酶活性的检测………………

5.2.2 GV 卵母细胞蛋白磷酸酶活性 PP1/PP2A 活性的测定……………

5.3 PP1/PP2A 对小鼠卵母细胞成熟过程的调控………

5.3.1PP1/PP2A 在小鼠 GV 卵母细胞 GVBD 的调节作用

5.3.2 PP1/PP2A 在 GVBD 后的减数分裂成熟过程以及受精中的作用…

6．结论………………

参考文献……………

附录

图版说明……………

实验图片……………

致谢

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