[硕士论文] 青岛市樱花品种的酯酶同工酶及RAPD分析 [复制链接]

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硕士论文-青岛市樱花品种的酯酶同工酶及RAPD分析，共55页，35003字

摘 要

本试验利用酯酶同工酶及 RAPD 技术对青岛市 19 个樱花品种进行亲缘关系鉴定和

品种分类研究。以一年生枝的树皮为材料进行了 19 个樱花品种的酯酶同工酶研究。为

确保樱花 RAPD 反应的稳定性和重复性, 本研究对基因组 DNA 的提取方法和 RAPD 反

应体系中 MgCl2 浓度、dNTPs 浓度、Taq 酶用量、引物浓度、模板 DNA 浓度、退火温

度、PCR 循环次数等影响扩增结果的重要因素进行了优化。利用优化的反应体系从 60

条随机引物中筛选出 32 条，然后进行二次筛选用于聚类分析，建立了 UPGAM 系统聚

类图。试验主要得到以下结论：

（1）青岛市 19 个樱花品种的酯酶同工酶酶谱共有 12 条酶带，其中 P7 为基本酶带，

活性强，为所有供试品种所具有；其他谱带在各品种间存在缺省情况。

（2）青岛市樱花 EST 同工酶酶谱的系统聚类分析结果与形态学结果基本一致，证

明了种源、重瓣性和花色可作为品种分类的重要指标，有较好的稳定性。

（3）适于樱花基因组DNA提取的方法为改良的CTAB法。

（4）适于樱花RAPD扩增的最优反应体系为：20μl总反应体系中，1×PCR buffer，

2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTP，1U Taq酶，0.2μmol/L 10bp随机引物，20~30ng

模板DNA。最佳扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，38℃退火30s，72℃延伸2min，

循环40次，最后72℃延伸10min，12℃保存。

（5）从60条S系列随机引物中筛选出32条扩增效果较好的引物用于19个樱花品种的

RAPD扩增。32条引物共扩增出了533条带，其中多态性带为406条，多态率达76.17%。

平均每个引物扩增出16条带，s8和s107最多可达到21条。

（6）RAPD分析所得聚类图将19个樱花品种分为2大类群,第1类群主要为杂交樱系；

第2类群根据花的重瓣性、枝姿和花色又可分为2个亚类群和3类。证明了樱花的种源、

重瓣性、枝姿和花色都可作为资源调查和品种分类的重要指标。研究结果与以前形态学、

数量学、孢粉学和生物化学分类法的结果基本一致。

关键词：樱花；酯酶同工酶；RAPD；品种分类

目录

摘要………-1-

Abstract…-2-

第一章 前言1

1 樱花研究现状……………………2

1.1 樱花种质资源的研究…………2

1.2 樱花分类研究…………………2

1.3 樱花遗传育种方面的研究……3

1.3.1 培育抗性强、花色齐全的樱花品种………………3

1.3.2 培育兼具观花、观果和食果功能的樱花品种………4

1.4 樱花栽培繁殖技术的研究……4

2 观赏植物品种分类方法的研究4

2.1 形态分类法……………… 5

2.2 数量分类法……………… 5

2.3 孢粉学方法……………… 5

2.4 细胞学分类法…………… 6

2.5 生物化学分类法………… 6

2.6 分子生物学分类法……… 7

3 本研究的目的和意义……………9

第二章 青岛市樱花品种的酯酶同工酶研究……………10

1 材料与方法……………………10

1.1 试验材料…………………… 10

1.2 试验方法…………………… 10

1.2.1 酶液的提取……………… 10

1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶的制备…11

1.2.3 加样 11

1.2.4 电泳 11

1.2.5 卸胶 12

1.2.6 染色及酶谱记录………… 12

1.2.7 电泳资料的统计分析…… 12

2 结果与分析……………………12

2.1 樱花酯酶同工酶的电泳结果12

2.2 樱花酯酶同工酶的系统聚类分析…………………14

3 讨论……16

3.1 樱花酯酶同工酶研究的可行性分析…………………16

3.2 不同取样部位对同工酶研究的影响…………………16

第三章 青岛市樱花品种的 RAPD 分析…………………18

1 材料与方法……………………18

1.1 试验材料…………………… 18

1.2 试验方法…………………… 18

1.2.1 基因组 DNA 的提取与纯化…18

1.2.2 模板 DNA 的定量分析………19

1.2.3 RAPD 反应体系及扩增程序的优化………………19

1.2.4 引物的筛选……………… 20

1.2.5 RAPD 扩增反应……………20

1.2.6 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分离……………… 20

1.2.7 条带分析与数据处理…… 20

2 结果与分析……………………21

2.1 基因组 DNA 提取结果的检测21

2.1.1 不同 DNA 提取方法的紫外分光光度计检测比较…21

2.1.2 不同 DNA 提取方法的琼脂糖凝胶电泳检测比较21

2.2 RAPD 反应体系与扩增程序优化结果……………22

2.2.1 Mg2+浓度……………………22

2.2.2 dNTP 浓度……………………23

2.2.3 Taq酶用量……………………23

2.2.4 引物浓度……………………23

2.2.5 模板 DNA 浓度………………24

2.2.6 退火温度………………… 24

2.2.7 扩增循环数……………… 25

2.2.8 重复性试验…………………26

2.3 引物筛选结果………………26

2.4 RAPD 扩增结果………………27

2.5 樱花 RAPD 系统聚类分析……29

3 讨论……30

3.1 基因组 DNA 的提取与纯化……30

3.1.1 材料处理的分析……………30

3.1.2 DNA 纯化过程的分析………30

3.1.3 DNA 模板分子完整性的分析31

3.2 RAPD 反应的重复性和可靠性分析…………………31

3.3 樱花 RAPD 扩增分析…………31

第四章 结论33

参考文献…34

附录………38

致谢………41

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