[毕业论文] YsxC与核糖体大亚基相互作用的研究 [复制链接]

资料简介：

毕业论文-YsxC与核糖体大亚基相互作用的研究，共134页，54006字

中文摘要

核糖体是由 RNA 和蛋白质组成的大分子复合物，广泛存在于所有细胞中，

是蛋白质生物合成的唯一场所。核糖体的生物合成 (Ribosome Biogenesis) 是一

个复杂却高度有序的过程。主要包括核糖体 RNA 的转录、剪切、修饰，核糖

体蛋白的翻译、修饰，核糖体 RNA 和核糖体蛋白的折叠及组装，等一系列过

程。研究表明，多种 GTP 酶参与核糖体的组装。YsxC 蛋白是这类 GTP 酶中的

一员。它参与核糖体大亚基的组装过程。关于 YsxC 和核糖体相互作用的研究

可以为抗生素的研发提供新的靶位点，具有重要的意义。

本课题综合运用生化方法和电子显微技术，探究 YsxC 在核糖体大亚基组

装过程中的具体作用。首先，我们在大肠杆菌中克隆、表达 ysxC 基因，并进一

步纯化重组的 YsxC 蛋白。在此过程中，我们优化了现有蛋白纯化的方法，使

YsxC 蛋白的纯化更加高效。随后，我们探究了 YsxC 蛋白与大肠杆菌 50S 和

30S 亚基的体外结合能力。生化实验结果表明 GDP 状态下的 YsxC 可以在体外

与成熟的 50S 大亚基结合。最后，我们运用冷冻电子显微技术和单颗粒重构的

方法解析了 50S-YsxC 大分子复合物分辨率为 10.9 ? 的三维结构。结果证实了

YsxC 可以与 50S 亚基结合。进一步的分析发现 L1 可能是 YsxC 的结合位点，

并且存在其它可能的潜在位点。

本课题的结果为现有 YsxC 和核糖体大亚基相互作用的研究提供了直接的

结构生物学的证据，并为人们进一步的探究 YsxC 在大亚基组装中的具体作用

提供了重要的基础。

关键词： YsxC；核糖体的生物合成； 冷冻电子显微技术；三维重构

ABSTRACT

Ribosomes are ribonucleoprotein complexes that are responsible for protein

bio-synthesis in all living cells. Ribosome biogenesis is a highly regulated essential

process, which includes 1) RNA transcription, processing and modification, 2)

ribosomal protein translation and post-translational modification, 3) proper folding

of RNA and proteins, and 4) assembly of the rRNA and ribosomal proteins into

functional subunits. Recent works have demonstrated that multiple GTPases are

involved in the biogenesis of ribosome subunits. YsxC, which encodes a small

GTP-binding protein, is implicated in the maturation of the large ribosomal subunit.

YsxC is widely conserved in bacteria and represents an attractive target for the

design of new antibiotics.

In the present work, we employed biochemical and structural approaches to study

the structure and function of YsxC in the biogenesis of the large ribosomal subunit.

First, ysxC gene was cloned and expressed in E.coli. We optimized a protocol for

efficient YsxC protein purification. Next, we examined the binding ability of YsxC

to the 30S and the 50S subunits in vitro. Biochemical analysis indicated that

GDP-bound YsxC stably binds to the mature 50S subunits in vitro. Last, using

cryo-EM single particle reconstruction, we solved the three dimensional structure of

50S-YsxC complex at 10.9 ? resolution. The strucrual analysis indicated that YsxC

binds to the 50S subunit, and interacts with L1 protein. Moreover, we found that

there could be multiple binding sites of YsxC on the 50S subunit.

In summary, our findings provide convincing evidences for the interaction between

the 50S subunit and YsxC, and serve a basis for the future studies toward the

detailed elucidation of the function of YsxC in the 50S subunit biogenesis.

Keywordsbr />
YsxC;

Ribosome

biogenesis;

Cryo-Electron

Microscopy;

Three-dimensinal Reconstruction

目 录

第 1 章

引 言 ...... 1

1.1 原核核糖体结构和功能的概述 ...... 1

原核核糖体结构的概述 ........... 1

原核核糖体功能的概述 ........... 2

核糖体高分辨结构的研究历程 ............ 4

1.2 原核核糖体结合蛋白 ......... 5

参与原核核糖体小亚基组装的 GTP 酶 ............ 5

参与原核核糖体大亚基组装的 GTP 酶 ............ 5

1.3 核糖体结合蛋白 YsxC ....... 6

ysxC 是细胞生长的必需基因... 6

核糖体结合蛋白 YsxC 的晶体结构 ..... 6

结合蛋白 YsxC 与核糖体相互作用的研究 ...... 7

1.4 本课题的主要研究内容及意义 ...... 8

第 2 章

结合蛋白的研究意义 .. 8

亟待解决的问题 .......... 9

主要研究内容及实验流程 ....... 9

电子显微三维重构技术 ... 12

2.1 研究方法的选择 .. 12

结构生物学 ... 12

结构生物学的主要研究方法 . 12

研究方法的比较及选择 ......... 14

2.2 电子显微技术的成像原理 ............ 15

2.2.1. 电子光学系统 ............ 16

2.2.2. 真空系统 ....... 21

2.2.3. 供电系统及其他 ........ 22

2.3 三维重构的基本方法 ....... 22

2.3.1. 电子晶体学 ... 23

2.3.2. 单颗粒三维重构技术 23

2.3.3. 电子断层三维重构技术 ......... 24

2.4 单颗粒三维重构技术 ....... 25

第 3 章

单颗粒重构方法的概述 ......... 26

单颗粒重构方法— 二维图像处理技术 ......... 26

单颗粒重构方法— 三维图像处理技术 ......... 29

单颗粒重构的常用软件- SPIDER ...... 30

SPIDER 常用命令集.. 32

核糖体结合蛋白 YsxC .... 34

3.1 实验流程 . 34

分子克隆 ....... 34

蛋白诱导表达 ............ 34

蛋白的分离纯化 ........ 34

3.2 实验材料 . 34

菌株和培养基 ............ 34

常规生化试剂 ............ 35

质粒和引物 ... 35

蛋白纯化所用溶液及试剂 ..... 35

主要仪器设备 ............ 36

3.3 实验方法 . 36

PCR 反应扩增目的基因 ......... 36

pEASY-Blunt/ YsxC 重组质粒的构建和阳性质粒的提取 ....... 37

双酶切验证 ... 38

表达载体的构建和提取 ......... 39

表达载体和目的基因重组质粒的鉴定 ........... 41

重组质粒转化至表达菌株 ..... 42

在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白 ...... 42

目的蛋白的分离纯化 43

3.4 实验结果 . 44

引物设计 ....... 44

PCR 大量扩增目的基因 YsxC........... 45

pEASY-Blunt/YsxC 重组质粒的构建 45

表达载体 pET28-a (+)和目的基因重组质粒的构建 ... 46

目的蛋白 YsxC 的诱导表达 .. 47

目的蛋白 YsxC 的分离纯化 .. 48

3.5 分析讨论 . 52

第 4 章

已有研究方法的分析比较 ..... 52

本课题的实验方法 .... 53

蛋白纯化条件的优化过程 ..... 54

大肠杆菌核糖体的提取和分离 ..... 56

4.1 实验流程 . 56

4.2 实验材料 . 56

菌株和培养基 ............ 56

生化试剂 ....... 56

主要仪器设备 ............ 57

4.3 实验方法 . 58

原核核糖体 70S 的提取 ......... 58

原核核糖体大小亚基的分离和纯化 .. 58

4.4 实验结果及讨论 .. 59

第 5 章YsxC 与核糖体大亚基的体外结合 ............ 62

5.1. 实验流程 . 62

5.2. 实验材料 . 62

生化试剂 ....... 62

仪器设备 ....... 62

5.3. 实验方法 . 63

体外结合实验- 50S 亚基和 YsxC 的结合....... 63

体外结合实验- 30S 亚基 和 YsxC 的结合..... 63

5.4. 实验结果 . 64

YsxC 可以在体外与核糖体大亚基发生特异性结合 . 64

YsxC 无法在体外与核糖体小亚基发生特异性结合 . 66

5.5. 分析讨论 . 68

第 6 章

现有结论的比较分析 68

本课题的实验方法 .... 69

本课题结合实验方法的优势 . 70

复合物 50S-YsxC 三维结构的解析与研究 72

6.1 实验流程 . 72

6.2 实验材料 . 72

主要材料 ....... 72

常用试剂 ....... 72

主要仪器设备 ............ 73

6.3 实验方法 . 74

冷冻样品的制备 ........ 74

冷冻样品的观测 ........ 75

数据的自动化收集 .... 78

6.4 复合物 50S-YsxC 三维结构的重构 ........... 80

新任务的建立 ............