[毕业论文] Wnt信号通路对小鼠胚胎干细胞中Oct4表达的调控 [复制链接]

资料简介：

毕业论文-Wnt信号通路对小鼠胚胎干细胞中Oct4表达的调控，共57页，22591字

中文摘要

Wnt 信号通路在胚胎发育、细胞分化以及组织器官形态发生中起着重要

的作用。研究表明，Wnt 通路与小鼠胚胎干细胞多能性的维持有关，但作用

机制尚不清楚。Oct4 蛋白是早期胚胎发育过程中一个重要的转录因子，它

通过同 Sox2 蛋白协同调控下游基因的表达，有维持胚胎干细胞多能性的作

用。因此，我们推测 Wnt 信号对小鼠胚胎干细胞多能性的维持作用可能与

Oct4 的激活有关。在本研究中，我们研究了 Wnt 通路下游的入核因子 β-

catenin 对 Oct4 启动子的激活作用，并在 TCF 家族因子中找到了 β-catenin

可能的协同因子 LEF1。通过构建含 Oct4 启动子突变序列的报告载体，我们

对 Oct4 启动子中的激活位点进行了研究，发现其中一个 TCF/LEF 结合的保

守位点在 Oct4 启动子被 β-catenin 激活的过程中起着关键作用。最后，我们

在 Wnt 通路活化的小鼠胚胎干细胞研究 Oct4 的表达，发现 Wnt 信号有维持

Oct4 表达的作用。这些结果说明 Oct4 可能直接参与了 Wnt 信号维持小鼠胚

胎干细胞多能性的过程，从而为阐述 Wnt 通路与胚胎干细胞多能性的关系

提供了机理信息。

关键词：Wnt 信号通路，Oct4，多能性，激活，小鼠胚胎干细胞

ABSTRACT

Wnt signaling pathway plays an important role in embryogenesis, cell

differentiation and tissue and organ formation. Previous study shows that Wnt

pathway is related to the maintenance of pluripotency of mouse embryonice stem

cells, but the mechanism is still unclear. Oct4 is a significant transcriptional

factor in early development embryogenesis. Oct4 and Sox2 co-regulate the

expression of downstream genes and can maintain the pluripotency of embryonic

stem cells. Therefore, we hypothesized that the maintaining effect of

pluripotency of mouse stem cells by Wnt signal might involve the actication of

Oct4. We found a co-activator of β-catenin among TCF family factors: LEF1. By

constructing reporter vectors containing mutated Oct4 promoter sequences, we

studied the activation elements in Oct4 promoter and found that one conserved

TCF/LEF binding site was crucial to the activation of Oct4 pomoter by β-catenin.

We finally studied the expression of Oct4 in Wnt-activated mouse embryonic

stem cells, finding that Wnt signal can sustain the Oct4 expression. These results

demonstrate that Oct4 may directly participate in the process in which Wnt

signal maintains the pluripotency of mouse embryonic stem cells, providing

mechanism information for the relationship between Wnt signaling pathway and

pluripotency of embryonic stem cells.

Keywords：Wnt signaling pathway, Oct4, pluripotency, activation, mouse

embryonic stem cells

目录

第 1 章 引言 1

1.1 干细胞简介............ 1

1.2 胚胎干细胞的特点 2

1.3 小鼠胚胎干细胞的多能性调控网络 ........... 3

1.3.1 影响小鼠胚胎干细胞多能性的信号通路........... 3

1.3.2 影响小鼠胚胎干细胞多能性的转录调控因子... 5

1.3.3 信号通路和转录因子之间的关系.......... 7

1.4 课题背景... 8

1.4.1 Wnt 通路............ 8

1.4.2 Oct4....... 9

1.4.3 问题的提出 .... 11

第 2 章 实验材料和方法 .... 13

2.1 质粒的构建和扩增........... 13

2.1.1 克隆质粒和报告质粒.. 13

2.1.2 定点突变（Site-directed Mutagenesis） ........... 14

2.1.3 质粒的扩增 .... 14

2.2 细胞培养和报告基因检测............ 15

2.2.1 细胞培养 ........ 15

2.2.2 真核细胞转染 16

2.2.3 Dual-Luciferase 报告基因检测. 16

2.3 RT-PCR 和 Real-time PCR 17

2.4 细胞裂解和 Western Blot 检测 ..... 18

2.5 显微照像和免疫染色（Microscopy and Immunostaining） ........... 19

2.6 染色体免疫共沉淀（ChiP）........ 19

第 3 章 实验结果及分析 .... 21

3.1 Wnt 信号通路在未分化的鼠的胚胎干细胞中是活化的.... 21

3.1.1 Frizzled 受体的表达在 mES 细胞中具有特异性 .......... 21

3.1.2 β-catenin 的含量和定位与 ES 细胞的分化程度相关 .... 21

3.1.3 Wnt 的报告基因的活性水平与 ES 细胞多能性的关系 25

3.2 Oct4 启动子的克隆和分析............ 25

3.2.1 Oct4 启动子的克隆 ..... 25

3.2.2 Oct4 启动子的分析 ..... 25

3.3 β-catenin 对 Oct4 启动子的调控作用........ 26

3.3.1 β-catenin 对 Oct4 启动子的激活作用... 27

3.3.2 LEF1 可能是 β-catenin 的协同因子 ..... 27

3.3.3 其它形式的 β-catenin 稳定型对 Oct4 启动子的激活作用........ 28

3.4 Oct4 启动子上 TCF/LEF 反应元件的鉴定 ............ 30

3.4.1 通过突变进行反应元件的初步筛选 ... 30

3.4.2 确认反应元件的细胞内证据 .. 33

3.5 GSK-3 抑制剂可以维持 ES 细胞中 Oct4 的高表达........... 33

3.5.1 BIO 可以维持 ES 细胞中 Oct4 启动子的高活性 .......... 34

3.5.2 BIO 能维持 Oct4 在 ES 细胞中的表达 34

第 4 章 实验结论与讨论 .....37

4.1 实验结论 37

4.2 讨论 ........ 37

插图索引 ....... I

表格索引 ....III

参考文献 ......V

致谢 .... XI

声明 ..........

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