[毕业论文] 常见肿瘤相关的人类肝源蛋白质结构生物学的初步研究 [复制链接]

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毕业论文-常见肿瘤相关的人类肝源蛋白质结构生物学的初步研究，共73页

中文摘要

本课题主要对两类在衰老和肿瘤的研究中起重要作用的调控蛋

白——端粒相关蛋白和IκB抑制蛋白——进行了系统的结构生物学

研究。端粒相关蛋白可与端粒结合,共同完成对端粒长度调控、DNA

损伤修复、细胞周期、有丝分裂、细胞调亡等细胞基本生命活动的调

节；IκB家族成员Bcl-3可特异地与NF－κB家族成员和核蛋白

Pirin发生相互作用，激活NF－κB转录调控通路，与衰老和肿瘤也

有着密切的关系。我们以人类肝源蛋白质为实验材料，克隆及表达了

7种端粒结合蛋白（TRF1、TRF2、TIN2、PinX1、POT1、PIP1、hRap1）

和2种转录调控蛋白（Bcl-3、Pirin），经进一步亲和层析、离子交

换层析和凝胶过滤层析的分离纯化，得到大量的均一且稳定的高纯度

蛋白用于结晶实验，成功筛选出了PIP1、hRap1及Bcl-3-Pirin复合

物的晶体生长条件，并进行了优化。对这两类蛋白及其相关蛋白复合

物晶体结构的研究是抗肿瘤研究和其他新药开发的重要靶点。

关键字：端粒相关蛋白，Bcl-3，Pirin，结构生物学

Abstract

We primarily carry out our project on Telomeric binding protein and

I κ B protein playing an important role in the research for aging and

tumor. Telomeric-associated proteins specifically binding telemere, act

on the regulation of the telomeric length, the repair of DNA damage,

cell cycle, metosis, apoptosis, etc. I- κ B protein Bcl-3 specifically

interacting NF- κ B protein and nuleoprotein Pirin, activates

NF- κ B-dependent transcription pathway, intimately correlated with

aging and tumor. Employing human liver tissue cell as the material, We

efficiently clone and express 7 telomere binding proteins（ TRF1, TRF2,

TIN2, PinX1, POT1, PIP1 and hRap1） and 2 transcription-regulating

proteins(Bcl-3 and Pirin), ulteriorly purify them though the methods of

affinity, ion-exchange, and gel-filtration chromatography, finally we

obtain quantities of stabled, homogeneous and highly purified proteins,

successfully screen the crystallization- for ming conditions of PIP1,

hRap1 and Bcl-3-Pirin complex, and then optimize the conditions. The

study of Bcl-3 and related complexes is a significant target of the

research for anti-tumor and the development of novel medicine.

Keyword: Telomere, Bcl-3, Pirin, Structural biology

目录

第一章

第二章

引言 . 1

端粒相关蛋白结构生物学的初步研究 ... 3

2.1 端粒相关蛋白的研究背景..... 3

2.1.1 人端粒重复序列结合因子 TRF1 和 TRF2 ........ 3

2.1.2 TRF1 相关核蛋白 TIN2 ... 3

2.1.3 端粒酶抑制蛋白 PinX1 ... 4

2.1.4 端粒保护蛋白 POT1 ...... 4

2.1.5 POT1 结合蛋白 PIP1 ..... 5

2.1.6 人抑制剂激活物蛋白 hRAP1 ......... 5

2.2 材料与方法....... 6

2.2.1 端粒相关蛋白的生物信息学分析 .... 6

2.2.2 目标基因的克隆与鉴定 .. 7

2.2.3 端粒相关蛋白的表达与纯化 ........ 8

2.2.4 端粒相关蛋白晶体生长条件的筛选与优化实验 . 12

2.3 实验结果........ 12

2.3.1 端粒相关蛋白的生物信息学分析结果 ......... 12

2.3.2 目标基因的克隆与 PCR 鉴定 ....... 15

2.3.3 端粒相关蛋白的表达与纯化结果 ... 16

2.3.4 PIP1 和 hRap1 晶体生长条件的筛选与优化实验结果 ....... 24

2.4 端粒相关蛋白结构生物学研究的结果讨论 26

第三章 BCL-3 及其相关蛋白 PIRIN 结构生物学的初步研究. 28

3.1 ΚB 抑制蛋白家族研究背景 .. 28

3.1.1 NF-κB 与 IκB 蛋白家族的研究进展 28

3.1.2 IκB 家族成员 Bcl-3 及其相关蛋白 Pirin 的研究背景 ..... 28

3.2 材料与方法...... 29

3.2.1. Bcl-3 与 Pirin 的生物信息学分析 . 29

3.2.2 目标基因的克隆与鉴定 . 29

3.2.3 Bcl-3 及 Pirin 的表达与纯化 ...... 30

3.2.4 Bcl-3- Pirin 复合物共结晶条件的筛选与优化实验 ....... 31

3.3.1 Bcl-3 与 Pirin 的生物信息学分析结果 ........ 32

3.3.2 Bcl-3 及 Pirin 的表达与纯化结果 .. 32

3.4 BCL-3 及其相关蛋白 PIRIN 结构生物学研究的结果讨论 ......... 36

第四章 常见肿瘤相关的人类肝源蛋白质结构生物学初步研究的问题与展望 ...... 38

4.1 表达载体的选择.. 38

目标基因功能区片段的确定.. 39

蛋白质表达（不/低表达或包涵体）的难题及解决办法......... 39

蛋白质分离纯化的难题及解决方法...... 40

蛋白质晶体生长条件的筛选与优化...... 42

后续工作........ 43

参考文献 .... 44

致谢 ..... 46

声明 ........ 47

附录 蛋白质晶体学原理和方法 .... 48

5.1 蛋白质结构测定的主要过程.. 49

5.2 蛋白质结晶...... 50

5.2.1 蛋白质结晶的原理 ..... 50

5.2.2 结晶方法和技术 ....... 50

5.3 相位问题........ 51

5.3.1 确定相位的主要方法 ... 52

5.3.2 多对同晶置换法（MIR） 52

5.3.3 多波长反常散射法（MAD） ........ 53

5.3.4 分子置换法（MR） ...... 57

5.4 结构修正 ....... 58

5.5 模型质量分析结构修正...... 59

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