[硕士论文] 马铃薯S病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清的制备 [复制链接]

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硕士论文-马铃薯S病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清的制备，共71页，35063字

摘要

本研究的目的是构建马铃薯 S 病毒外壳蛋白基因的原核表达载体，使其在大肠杆

菌中高效表达，用表达的融合蛋白作为抗原制备抗血清，为进一步制备马铃薯 S 病毒

的 ELISA 检测试剂盒打基础。

用 PVS-cp 基因的上、下游引物及 pGEM-pvs 模板进行 PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳

显示扩增产物为一条分子量约为 890 bp 的特异条带。用 Ultrafree-DA 试剂盒一步离

心法回收 890 bp 的特异扩增片段，然后与 T 表达载体 pBAD/Thio 连接，重组质粒转

化受体菌 TOP10。经氨苄青霉素抗性筛选、质粒电泳检测、PCR 扩增 及 SphI 与 PstI

限制性内切酶的单酶切和双酶切鉴定，筛选到了阳性克隆，相应的重组质粒被命名为

pBAD-pvs。单独使用基因的引物或混合使用基因及载体的引物进行 PCR 检测，获得了

目的基因正向插入表达载体的目的克隆，对应的重组质粒命名为 pBAD-pvs+。

重组质粒 pBAD-pvs+中外源基因是受阿拉伯糖启动子控制表达的。在 42℃，TOP10

（pBAD-pvs+）用 2％阿拉伯糖诱导培养 4 小时后，SDS－PAGE 凝胶电泳显示表达产物

中有一条分子量为 46 KDa 的特异性蛋白条带，其大小与预期的融合蛋白相符，该蛋

白在总蛋白中的含量为 20.22%。在硝酸纤维素膜上进行 Western blotting 分析，结

果显示该融合蛋白与 PVS-IgG 有反应，形成明显的杂交带，表明该融合蛋白是 PVS-cp

嵌合基因正确表达的产物。

用溶菌酶破碎菌体，提取总蛋白，SDS-PAGE 显示表达的融合蛋白主要以包涵体

的形式存在。经 4 M 尿素洗涤后的包涵体蛋白，用超纯水 4℃过夜溶解，SDS-PAGE

显示得到了只含有该融合蛋白的水溶液，即建立了纯化该融合蛋白比较简便的方法。

经洗涤后的包涵体蛋白用 6 M 尿素溶解，在氧化型和还原型谷胱甘肽存在的条件下复

性，电泳显示得到了该融合蛋白纯度较高的水溶液。两种途径获得的蛋白溶液经浓缩

透析后作为制备抗血清的抗原。

除采用上述两种蛋白溶液外，含目的蛋白的 SDS-PAGE 胶条经液氮研磨后的粉末

也作为抗原。三种抗原同时免疫家兔，制备出了三种抗血清。琼脂糖双向扩散检测显

示，三种来源的抗血清与抗原均能形成明显的沉淀线，其中用研磨后的粉末作抗原得

到的抗血清效价为 1：256，其它两种抗血清的效价为 1：128。结果显示获得了目的

蛋白的特异性抗血清，大肠杆菌表达的该融合蛋白具有良好的免疫原性与反应原性。

关键词： 马铃薯 S 病毒；外壳蛋白基因；原核表达；融合蛋白；抗血清制备

目录

致谢…ⅰ

中文摘要………………ⅱ

英文摘要………………ⅳ

论文正文

一 引言………………1

二 文献综述…………3

马铃薯病害………3

1.1 马铃薯细菌与真菌病害……………3

1.2 马铃薯病毒病害及其病毒的研究进展3

1.2.1 马铃薯 X 病毒病及病毒……………4

1.2.2 马铃薯 Y 病毒和 A 病毒………4

1.2.3 马铃薯卷叶病毒…………………4

1.2.4 马铃薯 S 病毒…………………5

马铃薯抗病毒途径及抗病毒育种……6

2.1 马铃薯抗病毒途径………………6

2.2 马铃薯抗病毒病育种……………7

马铃薯抗病毒基因工程研究进展……7

3.1 病毒基因组编码蛋白介导的抗性7

3.2 RNA 介导的抗性…………………8

3.3 核酶介导的抗性…………………9

3.4 植物抗性基因介导的抗性………9

马铃薯脱毒与病毒检测方法…………9

4.1 马铃薯脱毒与快繁技术研究进展9

4.2 马铃薯病毒的检测………………10

4.2.1 指示植物法…………………11

4.2.2 电镜鉴定法…………………11

4.2.3 分子生物学检测方法………11

4.2.4、免疫学鉴定方法……………13

三 材料和方法………17

材料………………17

1.1 菌种、质粒及载体……………… 17

1.2 酶与试剂…… 17

1.3 LB 培养基……17

方法………………17

2.1 引物设计和合成…………………17

2.2 重组质粒 pGEM-pvs 转化 DH5α17

2.2.1 含氨苄青霉素平板的制备…17

2.2.2 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备（CaCl2 法）17

2.2.3 大肠杆菌 DH5α的转化……18

2.2.4 质粒小量提取（碱裂解法）18

2.3 PVS-cp 基因的 PCR 扩增…………19

2.4 PCR 产物的回收（Ultrafree-DA 法）…………………19

2.5 PVS-cp 基因表达载体的构建……19

2.5.1 PCR 产物（目的基因）与载体的 T-A 连接………19

2.5.2 大肠杆菌 TOP10 的转化……20

2.5.3 阳性克隆的筛选与鉴定……20

2.6 PVS-cp 基因原核表达的诱导……22

2.7 表达蛋白的鉴定…………………22

2.7.1 SDS-PAGE 鉴定………………22

2.7.2 Western blotting 检测…………23

2.8 目的蛋白的提取纯化……………24

2.8.1 细菌总蛋白的提取…………25

2.8.2 包涵体蛋白的洗涤…………25

2.8.3 包涵体蛋白的溶解和复性…25

2.8.4 复性后蛋白的透析浓缩……25

2.8.5、蛋白含量的测定…………26

2.9 抗血清的制备26

2.10 抗血清中 IgG 的纯化…………………27

2.11 抗血清效价测定…………………27

结果与分析……29

PVS-cp 原核表达载体的构建………29

目的蛋白的诱导与鉴定……………30

蛋白的提取与纯化…………………3 4

抗血清的制备…36

讨论………… 3 9

表达载体的选择3 9

PVS-cp 表达载体的构建……………40

2.1 PCR 扩增参数的优化……………40

2.2 T-A 克隆……40

2.3 阳性克隆的鉴定…………………41

3 PVS-cp 的原核表达41

4 目的蛋白的提取与纯化………………42

5 抗血清制备………42

参考文献………45

缩略语表…………………55

附录：溶液配制……57

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