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硕士论文-产几丁质酶卵寄生真菌厚垣普奇尼亚菌（Pochonia chlamydosporia）对根结线虫生防潜力的研究，共80页，62032字

摘 要

根结线虫（Meloidogyne spp.）是世界性分布的威胁农业生产的主要病原物之一。该

病害严重威胁我国保护地蔬菜和果树的生产。化学杀线剂给环境和农产品带来安全隐

患，而利用天敌真菌防治植物线虫病害的生防措施成为替代措施之一。

本研究对从 7 株不同来源的根结线虫卵寄生真菌—厚垣普奇尼亚菌进行了生物学和

生化特性及其对南方根结线虫的生防潜力的研究。

1 采用玻片和平板菌落培养的方法，对 7 株不同来源的卵寄生真菌—厚垣普奇尼亚

菌进行了形态学观察和比较。结果表明，不同菌株在形态和培养性状上存在明显差异。

各菌株在 CMA 培养基上的生长速率不同，CFCC80919 生长最快，气生菌丝发达；

CFCC80919 和 CFCC84964 菌落背面乳白色；QNAV97-5 分生孢子梗细长。7 个菌株均

能够产生菌丝膨大和厚垣孢子，其中 QNAV97-6 和 CFCC84963 厚垣孢子着生方式除间

生外还有侧生，NRRL13094 厚垣孢子大量间生成串，CFCC84964 和 CFCC84963 厚垣

孢子稀少。QNAV97-2、QNAV97-5、CFCC84963、NRRL13094 和 CFCC80919 能产生晶

体。

2 厚垣普奇尼亚菌各菌株在玉米粉液体培养基内产生厚垣孢子的能力不同，菌株

CFCC84964 产厚垣孢子能力最强，菌株 CFCC84963 产厚垣孢子能力最弱。在第 2d，7

个菌株都没有产生厚垣孢子；第 4d 厚垣孢子的产生出现差异，菌株 QNAV97-2、

QNAV97-6、CFCC84964 和 CFCC80919 开始有厚垣孢子产生；第 20d，菌株 CFCC84964

厚垣孢子可达到 106.65×104 个/mL，菌株 CFCC84963 厚垣孢子仅有 29.12×104 个/mL。

3 7 株厚垣普奇尼亚菌在含有 0.2%胶体几丁质(colloidal chitin)作为主要 C 源和 N 源

的半液体培养基内，他们的培养滤液存在明显差异。其中 QNAV97-5、QNAV97-6 和

CFCC84963 培养滤液未测定出几丁质降解酶活性。具有几丁质降解酶系的 4 个菌株从

第 2d 开始测定出活性，CFCC80919 酶活性上升迅速，第 12d 就达到酶活性高峰值 10.99

μmol /h mL，随后缓慢下降；而 QNAV97-2 和 CFCC84964 第 24d 达到酶活性高峰，分

别为 21.39 μmol /h mL 和 17.30 μmol /h mL，至 32d 仍保持高峰活性水平；NRRL13094

第 28d 达到酶活性高峰值 15.79 μmol /h mL，随后略有下降。

4 7 株厚垣普奇尼亚菌从第 2d 开始均能产生几丁质外切酶（ N-acetyl-β-D-

glucosaminidase）。其中 CFCC80919、CFCC84964 培养滤液第 6d 达到酶活性高峰,至 32d

一直保持高水平活性，稳定在 0.21- 0.23 μmol /h mL 之间；而 QNAV97-2 培养滤液酶活

性第 4d 快速上升至 0.13μmol /h mL，随后下降，20d 后又明显上升，第 28d 达到高峰值

0.20μmol /h mL；NRRL13094 培养滤液酶活性第 14d 达到高峰值 0.09 μmol /h mL，随后

下降。在未测定出几丁质降解酶系的 3 株厚垣普奇尼亚菌中，QNAV97-6 和 CFCC84963

培养滤液几丁质外切酶活性较高，第 6d 达高峰值，分别为 0.21μmol /h mL 和 0.17μmol /h

mL；QNAV97-5 酶活性缓慢上升，至 30d 达高峰值 0.13μmol /h mL。

5 应用含 0.01%糖基化几丁质的改良 SDS-PAGE 电泳检测厚垣普奇尼亚菌具几丁质

酶活性的蛋白谱带，并估算他们产生的几丁质酶的分子量。CFCC84964 有 4 条几丁质

酶活性谱带，分子量分别为 17kDa、19.1kDa、22.9kDa 和 26.3kDa；CFCC80919 有 2 条

几丁质酶活性谱带，分子量分别为 27.5kDa 和 38.9kDa ；QNAV97-2 有 2 条几丁质酶活

性谱带，分子量分别为 39.8kDa 和 50.1kDa；NRRL13094 有 2 条几丁质酶活性谱带，分

子量分别为 81.3kDa 和 97.7kDa。厚垣普奇尼亚菌具有较高产生几丁质酶的活性，其产

生的几丁质酶可以引起根结线虫卵壳的裂解，抑制根结线虫卵的孵化。

6 厚垣普奇尼亚菌 7 个菌株的几丁质酶培养滤液对根结线虫卵孵化具有不同程度的

抑制作用。28℃下培养，7 个菌株的培养滤液在浓度递增的情况下，对根结线虫的卵孵

化抑制率随时间的增加而递增。其中培养 7d，25%浓度的培养滤液对根结线虫的卵孵化

抑制率最大。比较 25%浓度下各菌株对根结线虫卵孵化的抑制率可知，菌株 QNAV97-2

对根结线虫卵孵化的抑制率最高，7d 可达到 55.15%；菌株 CFCC84963 对根结线虫卵孵

化的抑制率最低，7d 达到 12.14%。

7 对测定出几丁质降解酶活性的 4 个厚垣普奇尼亚菌培养 2 周后，在 2%水琼脂培

养基上直接测定菌丝对根结线虫卵和雌虫的寄生情况。 QNAV97-2、 NRRL13094、

CFCC84964 和 CFCC80919 都可以寄生根结线虫的卵和雌虫，卵寄生率分别为 55.62%、

57.13%、47.87%和 52.75%；雌虫寄生率分别为 85%、90%、80%和 95%。菌丝对卵和

雌虫的寄生程度有差异。

综上所述，厚垣普奇尼亚菌 QNAV97-2、NRRL13094、CFCC84964 和 CFCC80919

生防潜力较高，具有应用前景。

关键词：根结线虫；厚垣普奇尼亚菌；生物防治；几丁质酶

目录

摘要······· I

前言·······1

1 根结线虫病害防治的经济重要性···········1

2 根结线虫病害传统防治存在的问题·······1

3 根结线虫的习性与危害·············3

4 根结线虫病害生物防治研究和应用进展·············4

4.1 食线虫真菌的研究····5

4.2 国内外生物制剂的研究········14

4.3 生防制剂与添加剂的关系····15

4.4 根结线虫生物防治稳定性的关键因素············18

5 线虫生防菌厚垣普奇尼亚菌的研究进展···········20

5.1 厚垣普奇尼亚菌的分类地位20

5.2 厚垣普奇尼亚菌的生物学特性··········21

5.3 厚垣普奇尼亚菌的应用········22

第一章 7 株卵寄生真菌厚垣普奇尼亚菌的形态学比较····25

1 材料与方法····25

1.1 供试菌株····25

1.2 实验所用培养基······25

1.3 菌落性状培养方法··25

1.4 玻片培养方法··········25

2 结果·26

2.1 厚垣普奇尼亚菌室温培养的形态特征描述····27

2.2 菌落培养性状比较··31

2.3 各菌株培养物生长发育状况比较······32

第二章 7 株卵寄生真菌厚垣普奇尼亚菌厚垣孢子形成能力测定··33

1 材料与方法···33

1.1 供试菌株····33

1.2 产厚垣孢子培养条件············33

2 结果·33

第三章 厚垣普奇尼亚菌产生几丁质酶的研究·····35

1 材料与方法···35

1.1 供试菌株····35

1.2 供试试剂的配制······35

1.3 产几丁质酶培养条件············36

1.4 几丁质酶活性测定··36

1.5 几丁质酶活性染色··38

1.6 蛋白染色····39

2 结果·39

2.1 几丁质酶活性测定的结果····39

2.2 几丁质外切酶活性测定结果40

2.3 几丁质酶活性染色测定结果40

2.4 蛋白染色测定结果··41

第四章 厚垣普奇尼亚菌菌培养滤液对根结线虫