[硕士论文] 葡萄离体再生体系及遗传转化体系的初步建立 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-葡萄离体再生体系及遗传转化体系的初步建立，共62页，38765字

摘 要

以葡萄砧木品种‘F-242’（Fercal，Berl.Colombard NolA×333EM）带芽新梢和酿酒葡

萄品种‘霞多丽’（Vitis Vinifera（L.），Chardonnay）胚性细胞团为材料，初步建立了葡萄

砧木品种‘F-242’离体茎段再生体系，酿酒葡萄品种‘霞多丽’胚性细胞悬浮系和遗传转化

体系，为进一步研究葡萄的遗传转化和进行葡萄转基因育种提供了理论依据和技术支

持。

以葡萄砧木品种‘F-242’带芽新梢为材料，研究了消毒时间，激素种类及其浓度配比，

基本培养基对外植体生根的影响。结果表明，消毒时间长短对葡萄无菌繁殖系的建立影

响很大，75%乙醇 15s，结合 0.1%的升汞 8min 为葡萄砧木品种‘F-242’最佳的外植体消

毒时间。附加生长素类物质 IAA 和 IBA 可以明显促进‘F-242’外植体生根，且 IAA 处理

的综合效果要明显优于 IBA，IAA 的最佳附加浓度为 0.1mg/L。不同的基本培养基对葡

萄品种‘F-242’外植体生根影响显著。其中在 MS 基本培养基上培养的外植体生根率为最

高。

以葡萄砧木品种‘F-242’试管苗为材料，研究了外植体类型（叶片、茎段、叶柄），

激素种类及其浓度配比，基本培养基、暗培养时间对不定芽诱导的影响。结果显示，以

茎段为外植体的不定芽诱导率为最高，其次是叶柄。茎段的最适培养基为 MS+6-BA

2.0mg/L +IBA 0.05mg/L，诱导率最高可达 30%。前期暗处理对不定芽的诱导影响显著，

2 周为最佳的暗培养时间。

以‘霞多丽’胚性细胞团为材料，初步建立了‘霞多丽’悬浮系，并研究了不同激素及

其浓度配比，不同种类及浓度的碳源以及谷氨酰胺对悬浮细胞生长的影响。结果表明，

2,4-D 和 NOA 均可以抑制胚性细胞的分化，但 2,4-D 更有利于细胞的增殖，最佳的 2,4-D

附加浓度为 1mg/L。同等浓度的麦芽糖比蔗糖更利于细胞的生长，15g/L 为霞多丽胚性

悬浮细胞生长的最佳蔗糖浓度。附加谷氨酰胺可以显著提高悬浮细胞的生长，其中以

500mg/L 为最佳。

以‘霞多丽’胚性悬浮细胞为材料，利用农杆菌介导法，开展了遗传转化体系的建

立工作。通过对农杆菌菌液的浓度及侵染时间、乙酰丁香酮（AS）浓度、共培养时

间等进行深入研究，初步建立了‘霞多丽’胚性悬浮细胞遗传转化体系。结果表明，以

OD600=0.6 的农杆菌侵染‘霞多丽’胚性悬浮细胞 10min，获得了最佳的遗传转化率。

AS 可以有效提高转化效率，100μmol/L 是其最佳的附加浓度。共培养时间的确定是

遗传转化的关键，其中以共培养 2d 效果最佳。

关键词：葡萄；快繁体系；再生体系；悬浮细胞；转化体系

目 录

摘 要...... I

ABSTRACT ........ III

缩略词对照表........ V

前 言...... 1

1 葡萄砧木‘F-242’离体器官再生体系的建立 ..... 11

1.1 材料与方法.... 11

1.2 结果与分析.... 13

1.2.1 ‘F-242’无菌繁殖系的建立 ........... 13

1.2.1.1 消毒时间对‘F-242’外植体成活率的影响 13

1.2.1.2 IAA和IBA对‘F-242’外植体生根的影响 ... 14

1.2.1.3 不同基本培养基对‘F-242’外植体生根的影响 ......... 15

1.2.2 ‘F-242’离体器官再生体系的建立 ................ 15

1.2.2.1 外植体接种后的形态变化 ........ 15

1.2.2.2 不同外植体不定芽诱导情况 ..... 16

1.2.2.3 6-BA与IBA浓度配合对‘F-242’茎段不定芽诱导的影响............ 16

1.2.2.4 不同基本培养基对‘F-242’茎段不定芽诱导的影响 .. 18

1.2.2.5 暗培养时间对‘F-242’茎段不定芽诱导的影响 ......... 18

1.2.2.6 不定芽的生长及生根培养 ........ 19

1.3 讨论................ 19

1.3.1 ‘F-242’无菌繁殖系的建立 ........... 19

1.3.1.1 消毒时间对‘F-242’外植体成活率的影响 19

1.3.1.2 IAA和IBA对‘F-242’外植体生根的影响 ... 19

1.3.1.3 不同基本培养基对‘F-242’外植体生根的影响 ......... 20

1.3.2 ‘F-242’离体器官再生体系的建立 ................ 20

1.3.2.1 外植体材料的选择 ... 20

1.3.2.2 6-BA与IBA浓度配合对‘F-242’茎段不定芽诱导的影响............ 20

1.3.2.3 不同基本培养基对‘F-242’茎段不定芽诱导的影响 . 21

1.3.2.4 暗培养时间对‘F-242’茎段不定芽诱导的影响 ......... 21

2 ‘霞多丽’胚性细胞悬浮系的建立及植株再生 .... 22

2.1 材料与方法.... 22

2.2 结果与分析... 23

2.2.1 ‘霞多丽’胚性细胞悬浮系的建立 . 24

2.2.1.1 2,4-D和NOA对‘霞多丽’胚性悬浮细胞生长的影响 .. 24

2.2.1.2 碳源对‘霞多丽’胚性悬浮细胞生长的影响 ............... 25

2.2.1.3 谷氨酰胺对‘霞多丽’胚性悬浮细胞生长的影响 ....... 26

2.2.2 ‘霞多丽’胚性细胞的分化及植株再生 .......... 26

2.2.2.1 ‘霞多丽’ 胚性细胞团的诱导与保持 ......... 26

2.2.2.2 ‘霞多丽’体细胞胚的诱导及植株再生 ....... 26

2.3 讨论................ 28

2.3.1 NOA和 2,4-D对‘霞多丽’胚性悬浮细胞生长的影响 .... 28

2.3.2 碳源对‘霞多丽’胚性悬浮细胞生长的影响 . 28

2.3.3 谷氨酰胺对‘霞多丽’胚性悬浮细胞生长的影响 .......... 29

3 ‘霞多丽’胚性悬浮细胞遗传转化体系的初步建立............ 30

3.1 材料与方法.... 30

3.2 结果与分析.... 31

3.2.1 农杆菌侵染浓度的确定............... 32

3.2.2 农杆菌侵染时间的确定............... 32

3.2.3 乙酰丁香酮（AS）浓度的确定.. 33

3.2.4 共培养时间的确定...... 33

3.3 讨论................ 34

3.3.1 农杆菌的侵染时间及菌液浓度对‘霞多丽’胚性悬浮细胞遗传转化效率的影响 ......... 34

3.3.2 乙酰丁香酮对‘霞多丽’胚性悬浮细胞遗传转化效率的影响 ....... 34

3.3.3 共培养时间对‘霞多丽’胚性悬浮细胞遗传转化效率的影响 ....... 34

4 农杆菌介导葡萄遗传转化的初步研究 .............. 36

4.1 材料与方法.... 36

4.2 结果与分析.... 36

4.2.1 不同浓度的潮霉素对‘F-242’离体茎段不定芽诱导的影响 ......... 36

4.2.2 不同浓度的潮霉素对‘霞多丽’胚性悬浮细胞生长的影响 ............ 37

4.3 讨论................ 38

结 论.... 39

参考文献............... 41

图版...... 46

致谢.. 49

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