[硕士论文] 高毒力Bt菌株的筛选及cry2Ac10基因的克隆、表达和活性研究 [复制链接]

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硕士论文-高毒力Bt菌株的筛选及cry2Ac10基因的克隆、表达和活性研究，共66页，33247字

摘 要

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种具有高度特异性，对环境友好

的微生物杀虫剂，其 cry 基因也是应用最为广泛和最有潜力的抗虫基因。本试验从山东

省土壤中分离 Bt 菌株，然后通过生物测定筛选对鳞翅目夜蛾科昆虫具有高毒力的菌株，

并对筛选出的高毒力菌株的蛋白组成和杀虫蛋白基因型作相应的研究，在此基础上，分

离克隆新型的 Bt 的 cry 基因，研究该基因的表达和杀虫活性。本试验主要结果如下：

1 采用芽孢杆菌选择性培养基与晶体染色相结合的方法，从山东省采集的 750 份

土样中分离出 Bt 菌株 57 株，Bt 菌株的平均分出率为 7.6%。这些 Bt 菌株的晶体形态包

括菱形、圆形等形状。

2 以粘虫和甜菜夜蛾初孵幼虫为试虫进行高毒力菌株的初筛，菌液浓度为 6.0×

108cfu/mL 时，对粘虫初孵幼虫校正死亡率高于 50%的菌株有 QCL-1、QCY-3、QJN-1、

WRC-1、WZ-1；对甜菜夜蛾初孵幼虫校正死亡率高于 50%的菌株有 QCL-1、WRC-1、

HJY-1。对 Bt 菌株不同成分生物测定，试验结果表明菌株 QCL-1 对几种夜蛾科害虫的

毒力主要来自于芽孢和晶体混合物，菌株 QCL-1 对甜菜夜蛾初孵幼虫的毒力显著高于

标准菌株 HD-1，对粘虫和粉纹夜蛾初孵幼虫的毒力与标准菌株 HD-1 相当。

3 SDS-PAGE 分析菌株 QCL-1 杀虫晶体蛋白主要为 130kDa 和 70kDa 两种，利用

cry 基因的 PCR-RFLP 方法鉴定菌株 QCL-1 中含有 cry1Cb、cry1Fa、cry1Fb、cry2Ab 和

未知的 cry2A 类基因。

4 以菌株QCL-1质粒为模板，利用设计的cry2A类特异性引物FY2A5和FY2A3，PCR

扩增出1.9kb的目的片段，将其克隆到表达载体pET-21b（+），构建了T7启动子控制的大

肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry2Ac。序列分析表明，该基因的编码框由1872个碱基组

成，该基因编码的蛋白质由623个氨基酸组成，其中亲水性氨基酸占38.35％，疏水性氨

基酸占45.26％，酸性氨基酸占6.90％，碱性氨基酸占9.48％。蛋白质的分子量为69.7kDa，

等电点为8.825，为弱碱性蛋白质。该基因编码的氨基酸序列与已公布的Cry2Ac蛋白的

氨基酸序列均不同，氨基酸序列同源性在97.4%～99.7%之间。该基因的核苷酸序列已经

在GenBank登录（GenBank accession EF405952），并被Bt基因国际命名委员会确认为一

个新的cry2Ac基因，正式命名为cry2Ac10。

将重组表达质粒转化大肠杆菌 BL21（DE3），IPTG 诱导，SDS-PAGE 分析表明

该基因在大肠杆菌 BL21（DE3）中能够正常表达 70kDa 的蛋白。Cry2Ac10 蛋白生测结

果表明，该蛋白对棉铃虫、粘虫和粉纹夜蛾初孵幼虫具有高毒力，同时对甜菜夜蛾初孵

幼虫生长有抑制作用，其中对棉铃虫和粘虫初孵幼虫的 LC50 分别为 30.0μg/g 和 16.7μg/g。

关键词：苏云金芽孢杆菌；菌株分离；杀虫晶体蛋白；cry2Ac 基因；蛋白表达；生

物活性

目 录

中文摘要………1

英文摘要………3

前言

Bt 的生物学特征……………1

Bt cry 基因的克隆及应用……3

研究的目的意义……………12

试验材料与方法

试验材料…13

试验方法…15

Bt 菌株的分离 ……………15

Bt 菌株的室内生物测定和杀虫晶体蛋白 SDS-PAGE 分析…16

杀虫晶体蛋白基因型的鉴定………………17

cry2Ac 基因的克隆和序列分析……………19

cry2Ac 基因的表达………23

cry2Ac 基因表达产物的活性测定…………23

结果与分析

Bt 菌株的分离………………25

对几种夜蛾科昆虫高毒力Bt菌株的筛选……27

高毒力菌株杀虫晶体蛋白 SDS-PAGE 分析…30

QCL-1 菌株的杀虫蛋白基因型的鉴定………31

cry2Ac 基因的的克隆、序列测定和分析……32

cry2Ac10 基因的表达………37

Cry2Ac10 蛋白的生物测定38

讨论……………40

结论……………44

参考文献………45

附录 1 缩略词 50

附录 2 GenBank 登记资料 ……51

致谢 …………55

硕士期间发表的学术论文……56

导师组意见……57

学位论文独创性声明及学位论文版权使用授权书58

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