[硕士论文] AC2卫星DNA在家猪13/17罗伯逊易位研究中的应用 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-AC2卫星DNA在家猪13/17罗伯逊易位研究中的应用

摘要

罗伯逊易位包含罗伯逊融合和罗伯逊断裂两个内容，融合和断裂的位置都位于着

丝粒处，着丝粒主要有动粒和着丝粒 DNA 两个构架，其中着丝粒 DNA 对维持染色体的

空间结构、黏附姐妹染色单体、组装着丝点、遗传重组等都具有重要作用。猪着丝粒

DNA 重复序列分为两个家族，即 MC1 和 AC2。MC1 是由 340bp 的重复单体串联组成，

分布于猪的中或亚中着丝粒染色体（1-12）和 X 染色体上，而 AC2 主要是由 14bp 单

体构成的重复序列组成，位于所有的端着丝粒染色体（13-18）上。

根据已报道的家猪着丝粒卫星 DNA 序列设计引物，对正常家猪基因组 DNA 进行 PCR

扩增，得到家猪着丝粒区域的 AC2 卫星 DNA 序列，采用凝胶回收试剂盒将 800bp、500bp、

250bp 的序列进行切胶回收，回收片段经纯化后连接到 pGEM-T easy 载体，分别挑取 3

种回收片段的阳性克隆进行序列测定，序列测定后，以 AC2 序列的克隆质粒作为探针

前体，采用 PCR 法将 Dig-dUTP 随机插入 DNA 中，而使 DNA 被标记，随后利用荧光原位

杂交的的方法，对扩增片段进行家猪中期染色体定位并对 13/17 易位染色体进行检测，

结果如下：

1、AC2 序列分析结果表明 800bp 左右克隆的长度为 857bp；500bp 左右的克隆两

个 506bp 和 552bp；250bp 左右克隆的长度为 263bp。使用 NCBI 的 BLAST 工具，进行

比对分析，分析结果表明：857bp 前半部分 222bp 的片段与 NCBI 序列同源性高达 94%，

后半部分 NCBI 没有报道。同时 857bp 与 263bp 序列同源性为 86%，与 506bp 和 552bp

序列的同源性为 72.32%，说明可能 857bp 的片段，由 263bp 的片段和 506bp 或 552bp

共同进化而来。一般认为不同的重复单体在基因组进化过程中起源于同一个祖先片段，

通过一个或者多个短的原始片段经过复制或不均等交换、碱基取代和进一步复制和缺

失产生。

2、FISH 检测结果显示杂交信号位于家猪端染色体着丝粒区域，但杂交信号在端

染色体着丝粒区域强度并不一致，说明不同染色体 AC2 重复序列重复单元的拷贝数不

同，同时 13/17 易位染色体着丝粒区域有杂交信号，说明虽然 13/17 易位染色体的着

丝粒虽然融合为亚中着丝粒，但着丝粒区域卫星 DNA 含有端染色体着丝粒 AC2 卫星

DNA。

关键词:家猪；13/17 罗伯逊易位；卫星 DNA；荧光原位杂交

目录

中文摘要 ..... 1

英文摘要 ..... 2

英文缩写词表 ...... 4

引言 5

第一章文献综述 .. 7

1着丝粒的研究进展 . 7

1.1 着丝粒的基本结构及保守功能...... 7

1.2 动粒 .... 7

1.3着丝粒 DNA 8

1.4减数分裂驱动着丝粒进化... 10

2 FISH 的研究进展... 11

2.1荧光探针标记物 11

2.2荧光探针标记的方法.. 12

2.3FISH 技术发展过程中杂交分辨率的变化 .... 13

2.4 荧光原位杂交技术的几种衍生技术..... 13

3 罗伯逊易位的研究进展 . 15

3.1 罗伯逊易位 ........ 15

3.2罗伯逊易位的现状和内容... 16

3.3 罗伯逊易位研究的技术方法........ 16

3.4 罗伯逊易位对携带者的影响 ........ 18

第二章 AC2 重复序列家族序列分析 .. 20

1 试验材料 ....... 20

1.1 主要试剂及试剂 . 20

2 方法 ...... 20

2.1 主要试剂的配制 20

2.2 猪基因组 DNA 的提取 ...... 21

2.3 引物的设计与合成...... 22

2.4基因片段的回收、纯化、及测序 22

2.5 目的片段与载体的连接....... 22

2.6 大肠杆菌 DH5α 感受态的制备.. 22

2.7 重组质粒的转化及阳性克隆的筛选..... 23

2.8 重组质粒的 PCR 扩增鉴定 . 23

3 结果 ...... 24

3.1PCR 扩增结果.... 24

3.2重组质粒的 PCR 鉴定电泳图 ...... 24

3.3 序列分析 ... 25

4讨论 ..... 28

第三章 13/17 罗伯逊易位染色体着丝粒 DNA 的 FISH 检测 ........ 30

1试验材料 ...... 30

1.1 主要试剂 ... 30

1.2 主要仪器 ... 30

2 方法 ...... 30

2.1 主要试剂的配制 31

2.2 染色体标本的制备...... 32

2.3探针的标记 ........ 33

2.4探针纯化 ... 33

2.5探针的标记效率检测.. 33

2.6荧光原位杂交 .... 34

2.7杂交后的观察 .... 35

3 结果 ...... 35

3.1 染色体片采集 .... 35

3.2探针标记 ... 35

3.3标记效果的检测 36

3.4 荧光原位杂交 .... 36

4 讨论 ...... 37

4.113/17 易位染色体的辩认 .... 37

4.2探针标记效率检测的条件对检测效率的影响....... 37

4.3FISH 中杂交信号的影响因素及杂交信号的意义 . 38

4.4AC2 卫星 DNA 的 FISH 检测在罗伯逊易位中的意义 .. 38

结论 .. 40

参考文献 ... 41

致谢 .. 46

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